miR-223在肾透明细胞癌患者外周血中的表达及其临床意义

陈明成，贾洪涛

（1.锦州医科大学湖北医药学院 研究生培养基地，湖北 十堰 442000；2.湖北医药学院附属人民医院泌尿外科，湖北 十堰 442000）

肾细胞癌（renal cell carcinoma,RCC）由于其转移潜力高，是死亡率最高的泌尿实体肿瘤，且大约90% 的肾恶性肿瘤是RCC。约10%～20% 的病例在诊断时出现转移，约20%～30%在术后随访期间发生转移［1］。而肾透明细胞癌（clear cell renal cell carcinoma,ccRCC）是最常见的组织学亚型，国内统计分析数据显示透明细胞癌约占肾癌的89.6%［2］。转移性ccRCC 的预后随着新的靶向疗法得到了改善，但由于大多数患者出现抗药性［3］，仍然不佳。若能确定用于ccRCC 筛查、诊断和预测治疗反应的特定生物标志物，将显著改善此病诊断治疗和预后。尽管进行了许多研究，但迄今为止还没有在ccRCC 中发现可靠的分子预后标记。miRNA 是脊椎动物蛋白质编码基因表达的主要调节器，是生长、免疫反应、组织发育和组织特定功能维持等基本生物过程的关键调节器［4］。GANTIER 等［5］实验得出的平均miRNA 半衰期为119 h（约5 d）。自从发现miRNA 参与癌症发展以来，研究miRNA 在癌症中的生物学作用和临床相关性方面取得了显著进展［6］。累积的证据表明，循环miRNA 可能可用于检测各种不同类型的癌症，并提供治疗干预［7］。然而，识别具有临床价值的循环miRNA 仍然是一项耗时且具有挑战性的任务。近年来，国内外对miR-223 的研究也较多，牛少曦等［8］的实验结果表明，miR-223与ccRCC 的增殖与迁移可能具有重要关系。查阅文献可知miR-223 在急性脑梗死、强直性脊柱炎、胃恶性肿瘤患者外周血中表达异常［9-11］。但关于ccRCC 患者外周血中miR-223 的表达水平还有待进一步研究。所以本研究旨在探讨血浆miR-223水平诊断ccRCC、判断其预后及其与患者病理特征的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2017 年8 月至2019 年7 月在湖北医药学院附属人民医院诊断为ccRCC 患者的术前及术后7 d（miRNA 半衰期约为119 h）外周血浆标本40 例为实验组，其中男26 例，女14 例；年龄54～76 岁；运用TNM 分期分类，Ⅰ期肿瘤6 例，Ⅱ期肿瘤13 例，Ⅲ期肿瘤14 例，Ⅳ期肿瘤7 例。另收集2017 年8 月至2019 年7 月在湖北医药学院附属人民医院门诊体检的健康志愿者外周血液标本80 例为对照组，其中男50 例，女30 例；年龄50～70 岁。实验组和对照组所抽取的静脉无菌血样经过静置离心后取上清，保存于-80℃冰箱中冷藏。本研究经本院伦理审查委员会审查通过，标本获取得到实验对象本人知情同意。

1.2 方法

1.2.1 提取血样总RNA 讲行cDNA 逆转录 首先从-80℃的冰箱中抽取实验所需的血样，根据RNA 提取试剂盒的说明，使用Qiagen RNeasy lipid mini kit 试剂盒提取血液样品中的总RNA，采用紫外分光光度法测定提取物的纯度和浓度。分别加入M-MLV 逆转录酶、逆转录反应缓冲液、RNA 酶抑制剂、逆转录特异引物，使用Taqman miRNA试剂盒逆转录cDNA。逆转录特异引物序列为：CTCACAGTACGTTGGTATCCTTGTGATGTTTCGAT GCCATATTGTACTGTGAGTGGGGTAT。反应条件依次为16℃30 min；40℃30 min；80℃6 min。

1.2.2 实时定量PCR 检测血样miR-223 表达量按照实时荧光定量PCR 试剂盒说明书，使用ABI 7500 PCR 仪进行荧光定量，以u6 作为对照，对样品中的miR-223 的相对表达水平进行测定。u6 引物序列为：上游引物5-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'；下游引物5'-AAGGAAGCGCTGGATG-3'。反应条件依次为：95℃变性60 s；55℃10 s；55℃10 s。应用实验所得的CT 值得出肾癌患者术前血浆、肾癌患者术后血浆、健康人群外周血浆中miR-223的相对表达量。

1.3 统计学方法

数据经SPSS 21.0 统计软件分析处理。miR-223相对水平均以均数±标准差（）表示，行t检验；用Spearman 法分析miR-223 在外周血中的表达与临床病理特征的关系；用受试者工作特征（receiver operating characteristic,ROC）曲线评价外周血中的miR-223 表达水平在ccRCC 中的诊断价值。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-223 在实验组和对照组外周血浆中的表达

利用实时定量聚合酶链式反应（real-time polymerase chain reaction,RT-PCR）测得各组外周血浆中miR-223 的表达量，如表1 所示，实验组患者术前外周血中miR-223 的表达量显著高于对照组，差异有统计学意义（t=3.968,P=0.013）；实验组患者术后7 d 较术前外周血中miR-223 的表达量已明显减少，但仍高于对照组，差异有统计学意义（t=1.210,P=0.027）。

表1 各组中外周血miR-223 的相对表达 （）

表1 各组中外周血miR-223 的相对表达 （）

2.2 ccRCC 患者外周血中miR-223 的表达与肿瘤病理、患者临床特征的关系

如表2 所示，miR-223 在外周血中的表达与肿瘤TNM 分期、肿瘤大小（肿瘤最大直径）、肿瘤分化程度有关，差异有统计学意义（P＜0.05），肿瘤分期越靠后、体积越大、分化越差，其表达量则越高；与患者年龄、性别、肿瘤有无淋巴结转移无关，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 外周血中miR-223 的表达与临床病理特征的关系（）

表2 外周血中miR-223 的表达与临床病理特征的关系（）

2.3 外周血中miR-223 的表达诊断ccRCC 的临床价值

如图1 所示，ROC miR-223 曲线下面积为0.893。可知外周血中miR-223 的表达在区分ccRCC 患者和健康人群中具有较高诊断价值，对ccRCC 的诊断具有较高的敏感性和特异性。

图1 miR-223 诊断ccRCC ROC 曲线分析

3 讨论

ccRCC 在肾脏近端小管中发展，与希佩尔·林道综合征（von Hippel-Lindau disease，VHL 综合征）肿瘤抑制基因的双发失活有关。VHL 综合征是由VHL 基因的生殖系点突变引起的遗传性疾病，其特征是各种良性和恶性肿瘤的易感性。根据患者的基因型，VHL 综合征可分为四个亚型（1、2A、2B 和2C），它们与不同的表型相关，只有1 和2B 亚型使患者易患ccRCC［12］。

miRNA 被公认为与癌症形成和进展高度相关。累积的研究数据揭示了miRNA 的致癌性和肿瘤抑制性，它可以调节各种人类癌症的靶基因。miRNA 通过在特异性mRNA 的3+未翻译区域（3+-UTR）内进行互补配对来发挥生物功能，这通常通过mRNA 降解或转化抑制的方式导致靶基因表达的降低。自从发现miRNA 参与癌症发展以来，研究miRNA 在癌症中的生物学作用和临床相关性方面取得了显著进展。证据表明，miRNA 在正常组织和癌症组织之间表达不同，并且这种表达在不同的癌症类型之间也不同，这为癌症研究开辟了新的途径［13］。特别是一些细胞外miRNA 在血液中以相当稳定的形式循环，其循环特征被发现与几种癌症的进展和预后密切相关。以往的研究也证实循环miRNA 可能可用于检测各种不同类型的癌症，并提供治疗干预［14］。此后，miRNA 一直被用来作为研究各种类型癌症等疾病的生物学标志物。早在2009 年，VASILESCU 等［15］首次报道血浆中的miR-150 可用作血清生物标志物，用于诊断败血症患者。

已有研究表明miR-223 在许多人类癌症中具有上调作用，包括结肠直肠癌［16］、肺癌［17］和胃癌［18］。查阅文献可知miR-223 在急性脑梗死、强直性脊柱炎、胃恶性肿瘤患者外周血中表达异常［9-11］。但关于ccRCC 患者外周血中miR-223 的表达水平还有待进一步研究。本研究发现，ccRCC患者术前外周血中miR-223 的表达量显著高于健康人群；ccRCC 患者术后7 d 外周血中miR-223 的表达量较术前已明显减少，但仍高于健康人群。并且ccRCC 患者TNM 分期越靠后、肿瘤大小越大、肿瘤分化程度越低，miR-223 循环表达量越高，其表达量与患者的年龄、性别、肿瘤有无淋巴结转移无明显关系。miR-223 ROC 曲线下面积为0.893，可知外周血中miR-223 的表达在区分ccRCC 和健康人群中具有较高诊断价值，对ccRCC 的诊断具有较高的敏感性和特异性。

综上所述，miR-223 可能成为诊断ccRCC 的血清生物学标志之一，且与肿瘤的临床病理特征有一定关系，对患者术后的复查及预后亦有一定帮助。但本研具有局限性，在实际中的应用仍需扩大样本量，行进一步的研究。