酶联免疫法与全自动化学发光法检测乙肝表面抗原的特异度及敏感度比较

林丹丽，陈机琼，冯慧艳，赵尊，王毅轩

（广东省东莞樟木头医院 检验科，广东 东莞 523633）

乙型肝炎（乙肝）的感染是我国肝硬化、肝癌患者发病的重要因素，及时有效的防治对减少肝脏疾病的发生具有重要意义。乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）作为乙肝病毒表壳蛋白，具有传染性，通常与乙肝病毒共存，且存在于人体唾液、血液、汗液及分泌物中，临床常作为乙肝病毒感染的关键标志物。我国当前正常人群中血清HBsAg 含量低于0.5 IU/mL 的感染患者占近3%，此类人群多因试剂、检测方法等诸多因素无法检出，在此情况下，选择具有高灵敏度的试剂和检测方法对HBsAg 阳性的患者具有重要意义［1-2］。血清HBsAg 的检测方法多样，最为普遍的为酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA），如今随着检验技术的更新，化学发光免疫分析法（chemiluminescence immunoassay,CLIA）亦被逐步推广［3-4］。本文参考中和确认试验标准，通过对203 例患者HBsAg 的检测，比较酶联免疫法与化学发光法的效果。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择本院2017 年3 月至2019 年3 月就诊的203 例患者，利用真空采集管收集所有患者外周血标本，且无黄疸、无溶血、无脂浊，经10 min 高速离心后备检。本次试验开展前经院伦理委员会审核通过。

1.2 试剂和仪器

ELISA 法：选用北京万泰生物药业股份有限公司提供的试剂以及质控物，采用KC100 酶标仪；CLIA 法：选用深圳新产业公司提供的化学发光分析仪（MAGLUMI 2000 PLUS）及配套试剂、质控品和校准品等。HBsAg 的校准品和确认试剂盒均由深圳新产业公司提供，溯源至世界卫生组织，国际标准品，WHO HBsAg，adw2.00/558 亚型。由深圳新产业公司提供室内质控与其他仪器，如：低速离心机（BY-600A 型）、酶标全自动洗板机（PW-812）和酶标仪（KC100）。以上所有仪器均严格按照说明书进行操作，并在试剂有效期范围内使用。

1.3 方法

在检测开始前对所有仪器进行室内质控和保养工作，其中室内HBsAg 为1.2 IU/mL 的浓度水平，确认室内质控结果满意且仪器正常运行后，对患者血清进行上机检测，记录、保存好相应检查结果。

ELISA 法：根据试剂盒提供的说明书进行操作，此法出现带颜色产物，在波长为450 nm 下利用酶标仪对反应孔光密度（optical density，OD）值进行测定，在cut-off 值（临界值）0.105 及以上的即为阳性，以下则为阴性。

CLIA 法：在厂家保养校准维护仪器后进行分析，根据作业相关指导书进行试验，测定质控值结果，当S/O＞1.0 判定阳性，S/O＜0.9 判定阴性。

中和确认试验：严格根据试验说明进行操作，试剂与标本反应COI 值/对照试剂与标本反应COI值低于50% 为阳性，而50% 及50% 以上则为阴性(Po-Pe)/(1-Pe)=Kappa 值（Po 为观测一致率，Pe为期望一致率）。利用SPSS 21.0 软件计算受试者工作特征（receiver operator characteristic curve,ROC）曲线下面积，以特异度（假阳性率）为横坐标，灵敏度（真阳性率）为纵坐标绘制曲线。

对ELISA 法、CLIA 法的灵敏度、特异度、符合率、Kappa 值及ROC 曲线下面积做好分析比较。

其中Kappa 值可反应两种检测方法对比中和确认试验的吻合率，Kappa 值＜0 表明极差；0.00～0.20 为微弱；0.21～0.40 为弱；0.41～0.60 为中度；0.61～0.80 为高度；0.81～1.00 为极强。灵敏度=真阳性例数/（真阳性例数+假阴性例数）×100%；特异度=真阴性例数/（真阴性例数+假阳性例数）×100%；符合率＝（真阳性例数+真阴性例数）/总例数×100%。

1.4 统计学方法

使用Excel 录入试验结果，应用SAS 9.2 统计软件对全部结果进行分析。应用SPSS 19.0 分析，计量资料以百分率（%）表示，采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两种方法检测结果比较

203 例标本CLIA 法检测阳性48 例，ELISA 法阳性46 例，标准参考方法中和确认试验阳性48 例，与CLIA 法结果一致，见表1。

表1 两种方法检测结果比较 （例）

2.2 两种方法检测效果比较

针对同一批样品，比较中和确认试验，ELISA法和CLIA 法均有较高的特异度和符合率，但比较中和确认试验灵敏度不同，ELISA 法、CLIA 法的Kappa 值及ROC 曲线下面积，见表2。

表2 两种方法检测效果比较

3 讨论

HBsAg 阳性为人体感染乙型肝炎病毒的重要指标，临床检测过程中，受检测方法、试剂等因素的影响，常存在漏诊或误诊的情况，尤其是HBsAg 为弱阳性的患者，由于乙型肝炎病毒可经多种途径传播，一旦出现漏诊，可能导致严重后果。因此，选择具有高灵敏度的HBsAg 检测方法具有重要意义［5］。ELISA 法是以放射免疫分析方法为基础的固相酶联免疫法，该法将酶与待测物经化学反应连接，再经免疫反应将待测物和固体载体对应抗原、抗体结合，然后加入底物，使底物与酶产生颜色变化，最后依据颜色的深浅度对待测抗原、抗体的水平进行判断，该法常作为半定量或定性检测，对HBsAg 的检测有着高灵敏度、高特异度的优势，且操作简便，具有良好的可重复性，加之成本较低，临床使用广泛。但由于其操作程序繁琐，在加样以及洗板等环节中很有可能造成误差，加上外源性、内源性等物质的干扰，其检测结果精确度常受影响，如果为手工操作，人为误差不可避免［6-7］。结合临床报道数据，当HBsAg 基因变异或浓度较低时，检验灰区可能出现，王庆敏等［8］通过对7 家不同的HBsAg 筛查试剂进行评估，结果表明“灰区”的设置十分必要。因此，为确保检测结果的可靠性，对于临界值周围的标本常须采用中和确认试验进行复检。

CLIA 法又称化学发光免疫法，是经单克隆与多克隆（鼠/羊）HBs 抗体对HBsAg 进行测定。待测的抗原与HBsAg（生物素化/钌复合物标记）单克隆与多克隆抗体发生反应并形成相应抗原-抗体的复合物，经与链霉亲和素微粒相结合，在电磁吸附作用下，微粒被吸附于电极板上，经电压作用后复合物进行化学发光，其发光值经光学系统检测后，强度与待测抗原的浓度为正比。此法优越性明显，尤其是对于突变株检出率更高［9-10］。陈少彬等［11］通过对448 例患者血清筛查发现，CLIA法可降低ELISA 法漏检HBsAg 的风险。

特异度和灵敏度是评价实验真实性的指标，特异度是对实验明确非病人能力的反映，而灵敏度则是实验发现相应患者能力的反映。Kappa 值和符合率是评价试验可靠性的指标，也是对诊断标准结果和实验判定结果一致性的反映［12-13］。本研究采用ELISA 法以及CLIA 法对203 例患者血清中HBsAg 进行检测，比较标准检验方法，ELISA 法灵敏度低于CLIA 法，CLIA 法有较强的HBsAg 检出能力最强。部分研究显示在HBsAg 低于1 IU/mL浓度时ELISA 法可检出，最低可达0.317 IU/mL，而CLIA 法则可低至0.01～0.04 IU/mL（即5×10-6～2×10-5），与标准检测方法更加符合。CLIA 法特异度比ELISA 法略高，但CLIA 法灵敏度更高，检测结果更具有可靠性与真实性。ELISA 法以及CLIA 法Kappa 值分别为0.97 和1，两法符合率均很高，但CLIA 法符合率更高［14］。ROC 曲线属于一种准确、全面且有效的检验试验评价方法，曲线下面积是对实验价值高低的反映，通常面积越大（接近1.0），表明该诊断越具有更高的真实性［15］。本次研究的结果表明ELISA 法与CLIA 法ROC 曲线下面积依次为0.88、0.97，CLIA 法诊断价值更好。尽管ELISA 法常用于大批量的标本检测且漏检率极低，但易受洗涤、加样、仪器、温度等因素干扰，与此同时，由于钩状效应（HOOK效应）、周边效应、干扰物质（如类风湿因子、补体、自身抗体、脂血、溶血、甲胎蛋白等）因素对灵敏度亦有一定影响，双孔检测同一样品时可出现较大差异A 值，假阴性、假阳性常易出现。故ELISA 法需严格把控检验过程中所有环节。部分研究表明ELISA 法较CLIA 法低3～4 级的灵敏度，CLIA 法采用全自动仪器分析，可达到0.01～0.04 IU/mL 的灵敏度，且无需稀释高浓度的样品，可达到1 000 IU/mL 的线性高峰，CLIA 法有极强的抗干扰能力，现已逐渐成为应用广泛的主流方法［16-18］。安静娜等［19］通过回顾性分析ELISA 法检测及CLIA 法检测的HBsAg 结果，表明CLIA 法和ELISA 法均有较好的符合率，而CLIA 法通过半定量检测，有更高的敏感度，适用于在临床手术、血站筛查等对结果要求敏感的条件下应用。

综上所述，HBsAg 的中和确认试验是有较高灵敏度和特异度的HBsAg 确定检测方法，比较中和确认试验及ELISA 法、CLIA 法两种方法可得出以下结论：ELISA 法作为常规检测方法，有低成本、高灵敏度和特异度等优势，尤其适用于筛选大批量的体检标本；CLIA 法则有着较宽的线性范围和高特异度、灵敏度，适用于HBsAg 的定量检查，亦可检测ELISA 法的灰区结果，避免HBsAg低浓度或变异时的漏检。CLIA 法有着可靠、准确的测定结果，对比标准方法有着很高的符合率，诊断价值极高，但常受仪器设备以及高昂的试剂价格等因素限制。因此，针对HBsAg 检测方法可根据需求进行选择，条件允许范围内可直接采用CLIA 法。