藏猪EPAS1基因低氧适应相关位点与表达量研究

易胜男，孔小艳△，钱锦花，吕敏娟，朱 莉，苟潇*

(1.云南农业大学 动物科学技术学院，云南 昆明 650201；2.玉溪农业职业技术学院 动物科学系，云南 玉溪 653106 )

藏猪是高原重要畜种，也是典型的高原动物。通过长期自然选择和人工选择，藏猪表现出一系列高原适应的表型和生理特征[1-2]，具有长而浓密的鬃毛，其肺动脉平滑肌含量丰富，血红蛋白与氧结合和释放的能力显著高于低地猪种[3]，遗传背景单一，是研究低氧适应机制的重要遗传资源[4-5]。

内皮PAS1蛋白(endothelial PAS domain protein 1，EPAS1)基因编码低氧诱导转录因子2α亚基(HIF-2α)，该蛋白是低氧调控通路核心转录因子[6]。近年对高原民族和动物进行全基因组扫描，EPAS1基因是最广泛报道的低氧正选择基因。包括藏族人[7-8]、藏羚羊[9]、雪豹[10]、鹿鼠[11]、牦牛[12]、藏獒[13-14]等。目前EPAS1基因与藏猪低氧适应性关系仍不清楚。本研究选择滇藏线连续海拔(800-1800-3300 m)猪种和欧系杜洛克猪为对照，通过检测EPAS1基因编码区的遗传变异，筛选其低氧调控活性位点，通过检测EPAS1基因mRNA和蛋白表达量，探讨其低氧适应性表达，明确了EPAS1基因与藏猪低氧适应的关系。

1 材料与方法

1.1 试验材料

迪庆藏猪10头(海拔3 300 m左右)，采自云南省香格里拉市；撒坝猪10头(海拔1 800 m左右)，采自楚雄州种猪种鸡场；滇南小耳猪10头(海拔800 m左右)，采自滇南小耳猪保种场；杜洛克猪10头(海拔800 m左右)，采自西双版纳州；每组公母比例1:1。使用EDTA抗凝真空采血管，采集前腔静脉血5 mL，用于DNA提取；屠宰8月龄藏猪和杜洛克猪各5头，取心、肝、肺、肾、肺动脉、肌肉组织，液氮保存，用于总RNA的提取；取肺组织样品，中性固定液保存，用于免疫组化试验。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA多态检测 所有采集的血液样本用BioTeke全血基因组DNA快速提取试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)提取基因组DNA。根据猪EPAS1基因序列(GenBank登录号：NC_010445.4)，针对其16个外显子区，用软件Primer 5.0设计 PCR 引物序列，引物由北京迪纳兴科生物科技有限公司合成(表1)。PCR总体积为25 μL，含2 μL DNA(30 ng/μL)、1 μL 10 μmol/L正向引物、1 μL 10 μmol/L反向引物、11 μL Mix(北京天根生物技术公司)、10 μL ddH2O(双蒸馏水)。PCR扩增条件：94 ℃ 3 min;94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，34个循环；72 ℃ 5 min。PCR产物在上海美季生物有限公司进行测序。

表1 猪EPAS1基因的引物Table 1 Prime sequences of EPAS1 gene in pigs

1.2.2 荧光定量PCR 所采的组织样用RT-PCR试剂盒PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Ereser (Perfect Real Time)，Takara code DRR047A(大连宝生物公司)提取总RNA。用Primer 5.0软件设计引物，根据EPAS1基因的mRNA序列(GenBank登录号：NM_001097420)设计定量引物，上游引物 GACAGAGTCCCCGG，下游引物 TCAGGTTCCTCCTTC，产物长度120 bp；根据内参基因28S rRNA mRNA序列(GenBank登录号：DQ297674)设计定量引物，上游引物TGGAATGCGAGTGC，下游引物CCACCGTCCTGCTGT，产物长度142 bp，由北京迪纳兴科生物科技有限公司合成。荧光定量PCR反应总体积25 μL，含2 μL cDNA(约30 ng/μL)、1 μL 10 μmol/L正向引物、1 μL 10 μmol/L反向引物、12.5 μL SYBR Green Master(ROX)、8.5 μL ddH2O。PCR扩增在Bio-Red CFX96TM Real-Time PCR Systems上进行，50 ℃激活荧光信号2 min，95 ℃预变性10 min，95 ℃变性30 s，60 ℃/55 ℃退火30 s，72 ℃延伸35 s，40个循环，72 ℃延伸5 min。

1.2.3 免疫组织化学试验 取藏猪、杜洛克猪的肺组织制成石蜡切片(厚度4～8 μm)，用于免疫组织化学试验。兔IgG作为HIF-2α抗体，滴加稀释的一抗(兔IgG)在肺组织，37 ℃环境下孵育1 h左右，PBS洗涤3次，滴加生物素标记羊抗鼠/兔IgG，置于20～37 ℃环境中20 min，PBS洗涤3次。操作步骤参照即用型SABC二抗试剂盒和DAB显色试剂盒的说明书进行。阴性对照试验不加兔IgG。

1.2.4 统计分析 DNA序列由BioEdit软件比对，筛选变异位点。采用Excel 2010和SAS 9.0软件的卡方检验模块计算等位基因频率。采用Haploview软件估算单倍型频率和连锁不平衡分析。

2 结果与分析

2.1 EPAS1基因外显子突变位点SNP检测分析

对EPAS1基因编码区(16个外显子)进行测序，共检测到21个SNP(MAF>0.1)，均为同义突变。此外，发现在第14外显子A83409G为错义突变，密码子AGT突变成GGT，为丝氨酸变成甘氨酸，但是藏猪G等位基因的频率为0.800，杜洛克猪、滇南小耳猪G等位基因频率分别为1、0.600，藏猪突变等位基因的频率与低地杜洛克猪、滇南小耳猪的突变等位基因频率不存在显著性差异(P>0.05)，所以不是低氧优势位点，不计入21个SNP中。

表2列出了藏猪、撒坝猪、滇南小耳猪和杜洛克猪EPAS1基因21个SNP位点的基因型频率和等位基因频率，发现在C61310T(第6外显子)位点，藏猪T等位基因频率是0.600，平原杜洛克猪只有CC 1种基因型，T等位基因频率为0，但是海拔1 800 m的撒坝猪和800 m的滇南小耳猪T的等位基因的分别为0.900和0.967。G81330A(内含子)处，藏猪、撒坝猪、滇南小耳猪和杜洛克猪的A等位基因频率分别为0.438、0.880、0.080、0。这两个SNP的突变频率没有随海拔的变化而变化，因此，这两个等位基因的分布与海拔无关，不是低氧选择候选的位点。同理，对其他位点的分析比较，外显子位点(T81631C、A81922G、T81955C和C81992T)和内含子位点(T81302C、T81321A、C81358T、A81476G、A81490G、C81491A、T81534C、G82070A和C82150T)等位基因频率并未呈现海拔趋势，所以推测这些位点也不是低氧选择候选位点。在A79520G(第10外显子)处，藏猪G等位基因频率为0.731，撒坝猪为0.500，滇南小耳猪为0.333，杜洛克为0，基因频率有海拔趋势。第11外显子T80174C位点的C等位基因为藏猪独有，为海拔趋势位点。同理，内含子位点C81133T的基因频率有海拔趋势，外显子位点C80195T，内含子位点A79997G和T80081C具有藏猪独有等位基因，为海拔趋势位点。但以上6个海拔趋势位点之间关系不清楚，需要通过单倍型分析探讨低氧选择的搭载效应。

表2 4个猪群体EPAS1基因21个SNP位点基因频率海拔分布Table 2 Elevational frequency distribution of 21 SNPs of EPAS1 gene in 4 pig breeds

2.2 连锁不平衡分析和单倍型分析

运用 Haploview 软件对EPAS1基因21个SNP位点(MAF>0.1)进行单倍型分析，分群构建LD Plot图(图1)。图中方框颜色由浅到深代表r2值增加。如图1所示，这些位点间连锁不平衡程度未呈现明显海拔趋势，位点间未发生低氧选择的搭载效应。

2.3 EPAS1基因mRNA表达结果分析

对杜洛克猪和藏猪的心、肝、肺、肾、肺动脉、肌肉组织进行EPAS1基因mRNA表达水平检测，结果表明，EPAS1表达量在肺动脉最高(表3)；在心、肝、肺、肌肉组织中藏猪表达量均与杜洛克猪无明显差异(P>0.05)(表3、图2)，均在2倍之内。

2.4 免疫组织化学试验结果分析

基于EPAS1基因主要在肺表达，本研究对迪庆藏猪和低地杜洛克猪的肺组织通过免疫组化检测EPAS1基因编码蛋白HIF-2α的蛋白表达水平。图3为EPAS1在藏猪肺组织中蛋白表达的免疫组化结果，其中箭头所指的棕黄色或棕褐色颗粒为免疫阳性信号。而积分光密度结果显示，在肺组织中，藏猪HIF-2α蛋白表达量(16241.74)与杜洛克猪(15720.36)并无显著性差异(P<0.05)。

3 讨 论

EPAS1与各种疾病有关，普遍存在于哺乳动物体内，参与疾病的病理生理过程[15-17]。在高原适应研究中，作为HIF通路核心调控基因，EPAS1是在高原民族和动物中筛选到的明星基因。EPAS1基因可以下调藏族人群在高原低氧条件中的血红蛋白水平和肺动脉压，从而降低自身血液黏滞度，提高血流通畅性，钝化高原代偿性反应，逐渐适应高原低氧环境[18-19]。研究发现藏鸡的EPAS1基因编码区有一个错义突变位点(rs316126786G→A)，对应氨基酸从Tyr突变为Cys，基因频率与海拔明显相关，认为是藏鸡高海拔低氧适应重要的功能位点[20]。HIF通路在牦牛适应高原低氧环境中也发挥了重要作用，EPAS1在肺高血压、血管渗透和红细胞生成方面有重要作用[21]。在高原绵羊中发现EPAS1基因第12、16外显子区有与红细胞平均血红蛋白浓度和红细胞平均体积增加相关位点[23-24]。研究连续海拔的山羊[25]、绵羊[26]EPAS1基因中都含有随海拔变化基因频率也随之变化的海拔趋势位点，还存在非同义突变。牦牛的低氧适应基因试验中，以三江黄牛作为对照组，连续海拔的牦牛作为试验组，筛选EPAS1基因的SNPs，发现3个牦牛特异性SNPs，存在低氧优势单倍型，但是3个SNPs的基因频率并不是海拔趋势位点[22]。不同海拔高度引起低氧环境差异，EPAS1基因与藏族高海拔适应也有关联，也存在海拔趋势位点[27]。可以推测低氧环境对EPAS1基因的选择是一个连续过程。有关于藏猪的研究中，在董坤哲的研究中选取了2个海拔藏猪与3种平原猪筛选EPAS1基因SNPs，发现14个SNPs，有4个位点的基因频率在藏猪和平原猪之间有很大不同，有3个位点的基因频率有海拔趋势，说明EPAS1基因可能与海拔环境相关，可以在低适应过程中发挥作用[28-29]。

表3 不同类群猪种EPAS1基因的相对表达量(Ct值)Table 3 EPAS1 gene expression level in different pig breeds(Ct value)

图2 不同类群猪种间EPAS1基因的mRNA表达量的比较
Fig.2EPAS1 mRNA gene expression comparison between different pig breeds

以前藏猪低氧相关报道多以藏猪与低地猪种相比较，其分化位点不能排除种群间固有分化。本研究选取滇藏线连续海拔猪种藏猪、撒坝猪、滇南小耳猪和欧系杜洛克猪为对照材料，检测EPAS1基因编码功能位点和表达量变化，探讨该明星基因在藏猪低氧适应中的角色。在低氧相关位点筛选上，初步确定有21个SNP，其中6个位点呈现海拔趋势。为了验证海拔趋势位点是否为低氧正选择位点，通过单倍型连锁不平衡分析，6个海拔趋势位点间连锁不平衡程度并未呈现海拔趋势，未呈现低氧选择的遗传搭载效应，结果表明藏猪EPAS1基因不存在编码功能位点。作为低氧调控因子，本研究以藏猪和杜洛克为材料，利用荧光实时定量PCR检测了EPAS1基因低氧适应性表达谱，发现藏猪EPAS1基因在心脏、肝脏、肺、肌肉组织中mRNA表达量相较于杜洛克略高，但无显著差异，免疫组化结果也显示EPAS1蛋白表达量相较于杜洛克略高，亦无显著差异。结果与以前藏猪与低地猪表达量结果一致[29-31]。本研究结果初步表明，作为低氧适应明星基因，EPAS1基因在藏猪中未呈现低氧适应性表达谱，可能未受到低氧正选择，推测藏猪具有不同的低氧适应分子基础。藏猪的低氧适应是一个复杂的性状，在激活和稳定转录调控因子外，还会涉及到表观调控机制，如DNA甲基化、组蛋白修饰等，调控基因的选择性表达，影响器官的发育和个体生长[32]；且EPAS1有参与低氧有关的下游基因的表达调控[33]，如EPO、VEGF、VEGFR等，可以与相关基因进行关联分析，从而更好的评价EPAS1基因在低氧调控机制中的作用。