山羊精液冷冻保存研究进展

郭富强,张燕军*,王瑞军,李学武,张俊杰,徐冰冰,张家新,李金泉，2，3，4

(1. 内蒙古农业大学 动物科学学院，内蒙古 呼和浩特 010018;2. 农业部肉羊遗传育种重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010018；3. 内蒙古自治区动物遗传育种与繁殖重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010018;4内蒙古自治区山羊遗传育种工程技术研究中心，内蒙古 呼和浩特 010018)

中国山羊精液冷冻保存的研究是从20世纪80年代开始，至今尚未形成一套完整的山羊精液冷冻保存技术体系。由于山羊精子对低温非常敏感，低温抗打击能力差，冻融后部分精子的结构完整性被破坏，导致精子活力低，利用冻精人工授精后母羊受胎率低，不能应用于实际生产当中。为了提高精液冻融后精子的活力及精子结构的完整性，学者们在精液冷冻保存稀释液成分以及冷冻程序方面做了大量的研究。本文对山羊冻精技术的最新研究进展进行综述，旨在为其进一步研究提供一定的理论参考。

1 冷冻保护剂对精液冻融后品质的影响

冷冻保护剂在精液冷冻保存中可以明显提高精子冻融后的活率。

1.1 渗透性冷冻保护剂

渗透性冷冻保护剂可以通过精子细胞膜渗透到精子细胞内部，一方面提高了精子细胞内部渗透压，防止精子细胞脱水而导致精子大量死亡；另一方面增加了精子细胞内溶液浓度，从而降低了溶液的冰点，减少冰晶的形成，DMSO、甘油、乙二醇是目前最常用的渗透性冷冻保护剂。杨素芳等[1]研究发现，稀释液中添加6%和7%的甘油冻后效果显著好于3%和5%。甘油在常温下对精子有毒害作用，不仅会损伤精子顶体，还会破坏某些酶，所以近年来学者们为了寻找能够代替甘油的冷冻保护剂做了很多研究。Najafi等[2]报道在以大豆卵磷脂为主的稀释液中添加3%、5%和7%的乙二醇冷冻解冻后精子活率分别为52.0%、53.0%和56.2%，差异不显著。席利萌等[3]研究表明，在稀释液中添加3%和6%的乙二醇与6%的甘油都能明显提高山羊精子冻融后品质，其中3%乙二醇可以替代甘油。

1.2 非渗透性冷冻保护剂

卵黄、大豆卵磷脂以及一些糖类是目前普遍使用的非渗透性冷冻保护剂。由于非渗透性冷冻保护剂不能穿过细胞膜，提高了细胞膜外溶液浓度，导致细胞膜外渗透压高于细胞内，引起细胞内的水分向外流失，减少了细胞内冰晶的形成，从而可以减少精液冷冻过程中受到的损伤。但是其对精子也具有一定的毒副作用。山羊精浆中含有卵黄凝集酶，可以使卵黄中的卵磷脂水解为溶血卵磷脂和脂肪酸，溶血卵磷脂对精子有毒副作用，脂肪酸的释放会使精液pH下降，对精液冻融后的品质不利。卵黄是动物源性的冷冻保护剂，可能携带着病原微生物，存在生物安全隐患，所以近年来学者们试图通过寻找植物源性的冷冻保护剂替代卵黄。大豆卵磷脂(Soybean lecithin,SL)来源于植物，作为一种非渗透性冷冻保护剂在国外已经广泛应用在牛、马、羊、犬等家畜精液冷冻保存中，在牛上已经进行商业化生产。目前在山羊上冷冻保护剂主要还是以甘油、乙二醇、卵黄、大豆卵磷脂为主，添加量为甘油5%～7%，乙二醇3%～6%，卵黄10%～25%。国内关于大豆卵磷脂作为羊精液冷冻保护剂的研究报道比较少，国外有文献报道羊添加量最高为3.5%，Salmani等[4]研究发现，以卵黄为主的稀释液冻后精子活率为66.89%、质膜完整率为64.27%，而以大豆卵磷脂为主的稀释液分别为63.71%和62.93%；Forouzanfar等[5]报道在羊精液稀释液中添加1%大豆卵磷脂和20%卵黄都能够提高精子冻后活力和存活率且差异不显著；而 Najafi等[6]研究表明，在羊精液冷冻稀释液中添加1.5%的大豆卵磷脂冷冻效果要比1%浓度好。

糖类可以和精子细胞膜磷脂结合，在细胞膜外形成保护膜，降低精子在冷冻过程中的损伤程度。单糖是一种小分子碳水化合物，可以渗透到细胞内直接被细胞代谢为精子供能。双糖不能渗透到细胞内，提高了细胞膜外渗透压，导致细胞内水分向外流失，从而减少了细胞内冰晶的形成。多糖类物质不仅能够调节渗透压，也是一种抗氧化剂。De Leeuw等[7]研究表明，在牛精液冷冻稀释液中添加蔗糖可以显著提高精子活率和顶体完整率，而添加相同浓度的海藻糖效果没有蔗糖好。权国波等[8]则报道在云南半细毛羊精液冷冻稀释液中添加100 mmol/L海藻糖冻融后精子活力为46.07%，与蔗糖相比显著提高了冻融后精子的活力，顶体完整性蔗糖与海藻糖无显著差异，但都可以明显改善精子的顶体状态。阿布力克木·提力瓦尔迪[9]报道含有蔗糖的多浪羊冷冻稀释液解冻后精子活率显著高于含有乳糖的稀释液，其中添加4 g/mL蔗糖组解冻后精子活率为52%，显著高于1.53和3.6 g/mL乳糖组。阿布力孜·吾斯曼等[10]研究的结果与上述一致，对野生盘羊与巴什拜羊杂交F1代的精液进行冷冻保存，发现添加蔗糖的稀释液精液冻融后精子活率为48.6%、畸形率11.20%、顶体完整率为58.4%,其效果比添加乳糖和只添加葡萄糖的稀释液冷冻保存效果好。冷冻稀释液中糖的种类会显著影响精液冻融后品质，目前一般添加的是单糖和双糖。

2 抗氧化剂对精液冻融后品质的影响

抗氧化剂分为酶类抗氧化剂和非酶类抗氧化剂，通过在精液冷冻稀释液中添加合适剂量的抗氧化剂可以显著提高精液冻后品质。

2.1 酶类抗氧化剂对精液冻融后品质的影响

2.2 非酶类抗氧化剂对精液冻融后品质的影响

非酶类抗氧化剂非常多，学者们主要对番茄红素(Lycopene，LP)、维生素C、褪黑素(MLT)、维生素E、α-硫辛酸(Alpha-Lipoic acid，ALA)以及一些植物多糖类在冷冻稀释液中的作用进行了大量研究。维生素E是一种常用的抗氧化剂，可以抑制氧自由基的形成，阻止细胞膜的脂质过氧化反应，保护精子膜结构完整性；还可以清除自由基，防止精子发生冷休克。李志军等[14]在绒山羊精液稀释液中添加0.8 mg/mL 维生素E后，精子冻融后的活率可达38.35%，显著高于不添加组(32.86%)，冻融后精子畸形率为12.40%，显著低于不添加组(15.03%)。权富生等[15]在萨能奶山羊稀释液中添加维生素E显著提高了精子冻后的顶体完整率，冻后活力有所提高，但是效果不显著。而Vichas等[16]研究发现在羊稀释液中添加α-生育酚对精液冻后活力和质膜完整性没有影响。Banday等[17]报道在羊精液冷冻稀释液中添加 40 mmol/L牛磺酸可以显著提高精子冻后活力(66.66%)。Omur和Coyan[18]在美利奴羊精液稀释液中添加甲硫氨酸(1 mmol/L) 、姜黄素(1和2 mmol/L) 、鞣花酸(1和2 mmol/L)，与对照组和其他各组相比，显著提高了精子质膜完整性和线粒体活性。绿茶提取物是存在于绿茶叶片中的一种活性成分，其中含有茶多酚(Green Tea Polyphenols, GTP)，其化学结构中含有大量的酚羟基，可以提供大量的活泼氢使自由基灭活，使自身保持较高的稳定性进而清除细胞中的自由基以及抑制脂质过氧化反应，提高精子冻融后的品质。Mehdipour等[19]在以大豆卵磷脂和甘油为主的稀释液中添加绿茶提取物(10 mg/L)显著提高了总运动精子数、直线前进精子数、精子质膜完整性、线粒体活性，同时也降低了精子的凋亡率以及MDA水平。番茄红素具有很强的抗氧化性，是目前已知的最强抗氧化剂之一，也是类胡萝卜素的一种，具有很强的清除自由基的能力，其抗氧化作用是β-胡萝卜素的20倍、维生素E的100倍，在预防心脑血管疾病、抑制癌细胞扩散、防止细胞DNA受到自由基损害、延缓衰老等方面有着重要的作用。王艳华等[20]在山羊精液冷冻稀释液中添加1.0 mg /mL 番茄红素显著提高了精子冻后品质，精子活率可达52.04%，SOD、CAT、GSH-Px的活性显著高于对照组。李方舟等[21]研究结果表明，稀释液中单独添加及混合添加海带多糖和枸杞多糖都能提高山羊精液冻后品质。Toker等[22]将1 mmol/L半胱氨酸添加到羊稀释液中，与对照组相比，显著提高了精子活力和顶体完整率，降低了MDA水平。

通过在羊精液稀释液中单独添加以及混合添加合适剂量的抗氧化剂都可以显著提高精子冻后品质，但是不同抗氧化剂对不同品种羊的效果差异很大，还需要进一步深入研究和分析其内在的分子调节机制，从而更好地选择合适的抗氧化剂来提高精子冻融后的品质。

3 不同稀释比例、平衡时间、冷冻-解冻程序对精液冻融后品质的影响

冷冻-解冻程序主要是指在精液稀释、平衡之后到液氮冷冻保存这一段时间内采用的冷冻操作方法以及解冻的水浴温度与水浴时间，是精液冷冻保存技术中重要的一环，对精子冻后品质的影响非常大。目前关于精液的稀释倍数、平衡时间、平衡方法、熏蒸时间、解冻温度等对精子冻后质量的影响已经有很多的研究报道。牧人等[23]报道山羊细管冷冻精液的效果显著好于颗粒冻精，精子冻后活力可达54.1%。薛昌安[24]通过对山羊精液冷冻-解冻程序的优化，采用两步稀释法、降温平衡4.5 h、距离液氮面上方4 cm处熏蒸10 min投入液氮、37 ℃水浴中解冻30 s的方法明显提高了精子冻后质量，冻后活力可达43.3%。胡润环[25]发现温度接近4 ℃时，一步稀释法和两步稀释法差异不大，当室温为15 ℃时，采用一步稀释法冻后活率为30%，采用两步稀释法冻后活率可达45%，两者差异显著。一些研究者报道两步稀释法要好于一步稀释法，因为甘油在常温下对精子会产生一些毒副作用，而当温度下降到4 ℃时加甘油可以减轻对精子的损伤。胡日查等[26]通过采用一步稀释法、4 ℃平衡2.5 h、38 ℃水浴中解冻30 s的方法精子冻后活率可达46.99%。许诺[27]采用1：1一步稀释、隔水降温2 h的方法，精子冻后活力可达45.67%，顶体完整率为76.19%，质膜完整率为28.77%。Alcay等[28]将公羊精液按1：1比例稀释后，在5 ℃平衡2 h，用液氮蒸汽冷冻精液，然后在37 ℃水浴中解冻30 s后精子活力可达53.67%，顶体损伤率为36.33%。Sangeeta[29]将稀释好的精液装入0.25 mL冷冻细管密封之后在4 ℃环境中平衡2 h，冷冻-解冻后精子活力为40.78%。而Moustacas等[30]报道将稀释好的精液在5 ℃环境中平衡3 h，距离液氮面上方3 cm处熏蒸15 min，37 ℃水浴解冻30 s的精液品质较差，解冻后精子活力仅为20.9%。Taghilou等[31]将精液1：1稀释后在4 ℃平衡3 h后，放在含液氮的聚苯乙烯箱内，在离液氮表面上方5 cm处熏蒸20 min冷冻精液，在37 ℃水浴中完全解冻后精子活率为43.8%，质膜完整率为34.2%。

当前研究者们对精液的稀释比例主要是1:3和1:4，以一步稀释法平衡2～3 h和两步稀释法平衡3～4.5 h为主，平衡温度为4 ℃和5 ℃，液氮熏蒸时间为7～20 min，熏蒸高度为3～5 cm，解冻温度为37～38 ℃水浴30 s。另有一些研究者将精液按1:1和1:2比例稀释，采用40 ℃ 20 s、55 ℃ 6 s、55 ℃ 10 s等较高温度解冻。采用高温短时间的解冻方法能明显提高精子的活率，但是使用高温解冻精液容易造成精子全部死亡，所以控制合理的解冻时间非常重要。而平衡降温速率与液氮熏蒸高度对于精液冻后品质有极大的影响，目前主要使用水浴降温和多层纱布包裹降温两种方法使精液在规定时间内降到4～5 ℃。不同熏蒸高度对精液的冷冻速率不同，今后应该加强程序冷冻仪的推广及使用，研究出适合山羊精液冷冻最适的平衡降温速率以及冷冻速率，切实提高山羊冻精品质。

4 山羊冷冻精液在人工授精中的应用

20世纪60年代中期，奶牛业开始使用冷冻精液进行人工授精，逐步代替了液态保存的精液。目前，应用牛冷冻精液进行人工授精，效果已与鲜精无明显差异。近年来，学者们用山羊冷冻精液进行人工授精后受胎率低，与鲜精差异较大，所以不能用于商业化生产。Rekha等[32]用Tris-果糖-卵黄冷冻稀释液将绵羊精液冷冻-解冻后对22只母羊进行人工授精，3只怀孕，受胎率为13.6%。Salvador等[33]用山羊冷冻精液对551只母羊人工授精后受胎率为57.0%。Karatzas等[34]用山羊冷冻精液对635只母羊单次人工授精受胎率为44.9%。Govaere等[35]研究发现冷冻精液子宫角深部输精的妊娠率显著高于子宫体输精妊娠率。Kumar和Nagvi[36]报道用冷冻精液子宫颈人工授精(TCAI)对绵羊产羔率有显著影响，发情14 h和22 h后的母羊两次受精后的产羔率为19.3%，而发情10 h后母羊单次受精的产羔率为10%,说明采用TCAI技术，母羊发情后人工授精的时间间隔与次数对产羔率有显著影响。包牧仁等[37]采用子宫颈深部输精法对比了使用冷冻精液和常温精液人工授精后绒山羊的受胎率，结果表明，母羊在第一、第二情期利用冻精人工授精后的受胎率极显著低于常温精液人工授精后的受胎率；但是在第一、第二、第三情期使用冻精人工授精后受胎率与使用常温精液人工授精后的受胎率差异不显著。Dorado等[38]报道母羊在发情24 h内用冷冻精液子宫颈人工授精后的受胎率为45.45%，发情时间在24～36 h内人工授精后的受胎率为46.15%，发情时间大于36 h人工授精后受胎率为60%，结果表明母羊发情时间长短对受胎率没有显著影响，但是用冻精人工授精，适当延长发情母羊的配种时间可以提高母羊受胎率。Kharche等[39]报道，用山羊冷冻精液对32只母羊人工授精后17只怀孕，受胎率为53.13%。Yotov等[40]采用子宫颈深部输精法，用PMSG对山羊同期发情处理人工授精后的受胎率为60%，而自然发情母羊输精后的受胎率为37%，两者差异显著。Anakkul等[41]报道腹腔镜子宫内人工授精比子宫颈人工授精的成功率更高。Martinezrojero等[42]在非繁殖季节对母羊做同期发情处理后，采用腹腔镜子宫内山羊冷冻精液输精的受胎率为33.3%。Masoudi等[43]用冷冻精液对发情母羊进行阴道、子宫颈和腹腔镜子宫角人工授精，结果显示，利用腹腔镜人工授精的效果显著好于其他两种。Anakkul等[44]报道，山羊腹腔镜单侧子宫角人工输精的受胎率可达56.67%。

当前山羊冷配受胎率低的主要原因有四点：一是由于母羊子宫颈非常细，在输精过程中不能达到理想的输精深度；二是人工授精在输精过程中会对母羊造成不良的刺激；三是由于目前山羊冻精质量差且不稳定；四是与配种技术员不规范的操作有关。目前应用较多的是腹腔镜子宫内输精和子宫颈输精，腹腔镜子宫内输精比较复杂，操作要求高，但是母羊人工授精后受胎率高；子宫颈输精精液消耗量大，母羊受胎率低，但是由于成本低、操作简单，在目前实际生产当中应用最广泛。

5 展 望

山羊精液冷冻保存技术目前还处在发展当中，精子冻后活率低、冷冻精液人工授精后受胎率低是制约其发展的根本原因。目前学者们对稀释液成分和冷冻程序做了大量的研究，而对山羊精子冻融后的损伤机制没有深入研究。今后应该加强研发无动物源成分保存液、将性控技术与羊精液冷冻相结合。从山羊精子细胞水平深入到分子水平，从精子的超微结构以及在输精方法上进行更深入细致的研究，找出山羊冷冻精液输精受胎率低的原因，从而配制合适的稀释液以及确定合理的冷冻程序。解决这个技术难题不仅能够提高种公畜的利用率，便于开展国内外种质交流，而且将冻精技术应用到实际生产中可以推动繁殖新技术的发展，也为中国山羊业进一步发展提供理论依据和技术保障。