NTS与TES基因对EEC凋亡调控作用的研究

张效川，张 梦，郭 丹，马杏娜，补琪琪，张 磊，李 广

(西北农林科技大学 动物科技学院，陕西杨凌 712100)

神经降压素(neurotensin，NTS)广泛分布于中枢神经系统的神经递质和激素样神经肽。NTS通过作用于3个受体(NTSR1、NTSR2、NTSR3/sortilin)发挥生理和病理功能[1]，NTS/NTSR1参与调节多种肿瘤(例如乳腺癌、前列腺癌和肺癌等)的增殖、侵袭和分化过程[2-6]。Testin(TES)基因最早于1995年被发现，在睾丸中的表达量最高，但在其他组织中也有广泛的表达并具有多种生物学功能。在人类中，TES基因位于染色体7q31.2的FRG7G区，由于其在多种恶性肿瘤中缺乏杂合性，被认为是抑癌基因。此外，TES位于细胞质中，是局部粘连的组成部分[7]，参与细胞间的相互作用[8-11]。TES由1个PET结构域(在一些活性未知的蛋白质中发现)和3个标准排列的LIM结构域(结合不同蛋白质的蛋白质相互作用基序)组成。LIM结构域是细胞增殖、命运决定、分化的重要调节因子。子宫内膜上皮细胞(endometrial epithelial cells，EEC)会发生周期性变化，此过程既受外部因素和子宫内膜微环境(例如激素、细胞生长因子等)的调节[12]，又受子宫内膜特异基因的精密调控，不同阶段特异性基因的表达是形成EEC细胞阶段特异性结构及发挥特定细胞功能的基础。NTS与TES对子宫内膜生物学过程调控作用的研究较少，关于两者相互作用的研究几乎没有。此试验通过构建NTS和TES过表达载体转染EEC，检测 EEC 的凋亡率及p38和Caspase-8蛋白表达量，为进一步探究NTS和TES调控奶山羊EEC的凋亡机理提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为西北农林科技大学动医学院产科实验室前期构建好的体外奶山羊EEC细胞系。

1.2 pcDNA3.1过表达载体的构建

查询奶山羊NTS、TES基因编码区序列，通过 PCR Mix (Genstar)对其CDS 区进行扩增，分别用XhoI 和KpnI对扩增后产物进行双酶切，用T4DNA连接酶(Takara)及 pcDNA3.1(+)进行连接。为了检测TES的表达水平是否受NTS调控，将pcDNA3.1-NTS载体转染到EECs中。将pcDNA3.1-TES载体转染到EECs中，观察TES对NTS的调节。构建psiCHECK-2-NTS载体，引物:5'-GCCTCGAGCACTTAATGGGTTGTTGA-3'(F)和5'-GCGCGGCCGCTGATGGCTGTT GTCTTTT-3'(R)。构建pcDNA3.1-NTS载体，引物: 5'-CCCTCGAGATGATGGCAGGAATGAAAATC-3'(F)和5'-GGGGTACCTCAGTAGTAGTAAGAACCTCTT TTGAGTTG-3'(R)。

1.3 EEC的培养和转染

在37 ℃、5% CO2的环境中培养EEC细胞系，并提供含有10 %胎牛血清的DMEM/F12 细胞培养液(Gibco) 。将pcDNA3.1-NTS、pcDNA3.1-TES及pcDNA3.1分别转染至EEC，收集转染 24 h后的细胞用于细胞凋亡的检测试验；收集转染 48 h 后的细胞用于Western Blot试验。

1.4 Real-time PCR 和Western Blot检测

用Trizol(Invitrogen) 等提取细胞RNA；使用StarScript II第一链cDNA合成试剂盒 (Genstar) 获取互补DNA；使用2×RealStar Power SYBR Mixture(Genstar)进行qPCR，Ct值通过 CFX Connect实时PCR检测系统(Bio-Rad)，并使用2-ΔΔCt方法进行数据处理。 以下引物用于检测NTS mRNA水平：5'-TCAGTAAGGCAAGTGTTC-3'(F)和5'-CCATCTAAGGCAGCAGGA-3'(R)。

使用RIPA缓冲液(Heart)提取收集的EEC蛋白，并通过SDS-PAGE分离。NTS一抗来自BBI(D121026)。caspase-8、P38 MAPK和β-actin一抗和二抗购自Beyotime。

1.5 细胞凋亡检测

通过胰蛋白酶收集转染24 h 后的细胞，1 000 r/min 离心10 min，用预冷的 PBS 冲洗2 次，经Annexin V-FITC / PI细胞凋亡试剂盒(Multi Sciences)处理，使用流式细胞仪(BD FACSCalibur)检测。重复3次。

1.6 数据处理

使用SPSS 22.0进行数据分析，通过t检验进行差异比较，结果表示为平均值±标准误。P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 鉴定NTS、TES基因

对NTS和TES基因CDS区域序列进行PCR扩增，凝胶电泳检测结果见图1，克隆片段大小与NTS基因CDS区全序列(513 bp)以及TES基因 CDS 区全序列(1 266 bp)相符。

2.2 检测NTS和TES过表达载体效率

pcDNA3.1-NTS、pcDNA3.1-TES和pcDNA3.1转染EEC后提取RNA和蛋白质的检测结果见图2。由图2A、2B可知，pcDNA3.1-NTS与pcDNA3.1-TES转染EEC后，NTS与TESmRNA表达量极显著高于对照组(P<0.01)；Western Blot结果发现，pcDNA3.1-NTS转染后的NTS蛋白量显著高于pcDNA3.1组(P<0.05)，pcDNA3.1-TES过表达载体转染后的TES蛋白量显著高于pcDNA3.1组(P<0.05)(图2C、2D)。由此可见，过表达载体pcDNA3.1-NTS和pcDNA3.1-TES构建成功，可以用于后续试验。

2.3 NTS和TES过表达对EEC凋亡的影响

流式细胞检测结果见图3。与pcDNA3.1相比，pcDNA3.1-NTS 组EEC的凋亡率显著减低，由43.60% 下降到 34.79%(P<0.05)，pcDNA3.1-TES组EEC凋亡率也同样显著下降，由43.60%下降到34.52%(P<0.05)，表明NTS和TES过表达抑制EEC凋亡。

2.4 过表达NTS、TES对EEC凋亡相关蛋白表达的调节作用

为探究NTS、TES对EEC凋亡作用的分子机理，通过Western Blot试验检测了NTS、TES对细胞凋亡相关标志性蛋白的影响，包括caspase-8和P38 MAPK，结果如图4所示。与对照组pcDNA3.1相比，pcDNA3.1-NTS、pcDNA3.1-TES中Caspase-8的蛋白表达量都极显著降低(P<0.01)；两个过表达组中p38的蛋白表达量和磷酸化的p38水平都显著高于空载体pcDNA3.1组(P<0.05)。由此可知，过表达NTS、TES对Caspase-8有抑制作用，而对p38有促进作用。

2.5 NTS过表达对TES表达的影响

将pcDNA3.1-NTS载体转染到EEC后，经RT-qPCR和Western blot检测，TESmRNA和TES蛋白水平见图5。与pcDNA3.1组相比较，当NTS过表达时，TES的mRNA极显著降低，仅为pcDNA3.1组的1/10左右(图5A)，TES的蛋白质表达水平也降低至一半左右(图5B)。由此可知，过表达基因NTS在mRNA及蛋白水平上都可抑制TES的表达。

2.6 TES过表达对NTS表达的影响

如图6所示，将pcDNA3.1-TES转染至EEC后，NTS的mRNA水平没有明显变化(P>0.05)(图6A)，但是NTS的蛋白表达量显著降低(P<0.05)(图6B)，说明TES过表达对NTS表达有抑制作用。

3 讨 论

凋亡是一种细胞程序性死亡的生理过程。细胞凋亡可有多种因素调控发生。除一些细胞外因素可诱导细胞凋亡，相关凋亡基因通过多种凋亡信号通路也可调节细胞凋亡过程。细胞凋亡相关基因可分为促进凋亡基因(如C-myc、P53、Fas等)和抑制凋亡基因(如Bcl-2等)两种。现有研究中对于细胞凋亡过程调控多种细胞生长的作用有较深的研究，但对其具体的调控机理仍不清楚。研究发现，在乳腺癌细胞系中TES过表达激活 Caspase-8从而激活其所参与的凋亡通路[13]；Li 等[14]研究发现TES激活p38的作用从而抑制结直肠癌的进一步的发生过程；研究发现NTS可促进小肠上皮细胞增殖；NTS与结肠癌等恶性肿瘤有极其密切的联系[15]。目前对NTS和TES的研究多集中于单个基因的功能，且主要集中在癌症方面[16-17]，其中NTS和TES之间的相互作用及其对EEC凋亡作用的研究未见有报道。本研究结果显示，NTS和TES的过表达对EEC凋亡有抑制作用，增加p38的表达，而抑制Caspase-8的表达。通过 Real-time PCR和Western Blot等试验，发现NTS过表达显著抑制TES在mRNA 和蛋白水平的表达，而TES过表达对NTSmRNA表达水平无显著影响，但可以显著抑制NTS蛋白水平的表达，由此可知，NTS和TES在EEC 中存在负反馈调节作用，但NTS和TES的这种负反馈调节作用是否具有普遍性，在其它组织或细胞中是否也同样存在需要更多的研究证明。

4 小 结

过表达NTS和TES都对EEC凋亡具有显著抑制作用，对细胞凋亡相关蛋白Caspase-8和p38的调控作用相同，增加p38的表达，而抑制Caspase-8的表达；在EEC中NTS和TES存在负反馈调节作用，在mRNA和蛋白水平NTS过表达显著抑制TES的表达，而TES过表达也会抑制NTS 蛋白表达，但对其mRNA水平无显著影响。