饲粮添加阴离子盐对山羊瘤胃发酵参数及血钙调控的影响

简仕燕,杨 康,王 菲,马政发,郭子義,吴文旋,2,3*,吴佳海,牟琼

(1.贵州大学 动物科学学院动物营养与饲料科学研究所，贵州 贵阳 550025；2.贵州大学 新农村发展研究院，贵州 贵阳 550025；3.贵州山地畜禽粪便污染防控与资源化工程实验室，贵州 贵阳 550025；4.贵州省草业研究所，贵州 贵阳 550006)

低血钙是一种营养代谢性疾病，由于奶畜不能充分动用骨钙、肠钙吸收率降低、产后分泌初乳等原因造成钙损失过多，血钙浓度明显降低，严重可诱发真胃移位、胎衣不下、乳房炎等疾病，严重影响奶畜生产性能[1]，是动物营养学界致力解决的重要课题。历经灌服水溶性钙盐、注射维生素D或其活性形式(1,25-(OH)2D3)、产前饲喂低钙日粮等处理后，Block[2]报道降低日粮阴阳离子差(dietary cation-anion difference, DCAD)可增加钙吸收、提高血钙水平、维持血钙稳恒、防治低血钙，为该领域后续研究提供了基础[3-4]，而在饲粮中添加阴离子盐降低DCAD已成为当前防治低血钙的最常用手段[5]。

Ca2+的吸收包括3个步骤：首先，Ca2+经瞬时受体电位通道香草酸受体6(Transient receptor potential vanilloid receptor 6，TRPV6)介导顺浓度梯度扩散入胞；其次，入胞后Ca2+即与钙结合蛋白(Calcium binding protein D9k, CaBP-D9k)结合，并由细胞刷状缘膜顶膜转运至基底膜；最后，Ca2+在基底膜转运蛋白细胞膜钙泵(Plasma membrane Ca-ATPase 1b，PMCA1b)和钠钙交换体1(Na+/Ca2+exchanger1，NCX1)的作用下，逆浓度梯度由基底膜跨膜出胞，进入血液[6]。上述3个步骤均受维生素D受体(VDR)的调控。

本课题组前期研究发现，Ca2+吸收相关蛋白表达水平的提高与增加血钙浓度紧密相关[7-9]。CaBP-D9k、TRPV6和VDR可调控Ca跨细胞膜在肠道吸收这一途径，CaBP-D9k、TRPV6、VDR的表达水平越高，意味着钙的吸收越高，提示降低 DCAD 水平可上调这3个基因的表达水平而增强钙的吸收[10]。在本课题组开展的不同DCAD水平对羊血CaBP-D9k[7]、VDR[9]含量和瘤胃体外发酵参数[11]的基础上，本试验重点研究低DCAD水平饲粮对血钙稳恒及其调控因子水平与瘤胃内发酵参数的效应，为低DCAD防治低血钙和探讨山羊健康状况提供技术积累和基础数据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

采用交叉试验设计，以6只体况良好、年龄(3.5±0.2岁)、体重相近(42.6±2.1 kg)的黔北麻羊为试验动物，将其分为处理组和对照组，每组3个重复，每个重复1只羊。对照组饲喂基础日粮，由精料和羊草干草构成，设计DCAD(DCAD=Na+K-Cl-S, mmol/kg DM)水平为+150。根据文献报道和课题组前期研究结果，处理组在对照组日粮基础上添加阴离子盐MgSO4·7H2O，设计DCAD水平为-150。山羊日粮精粗比为40:60，组成及营养水平见表1。经测定，设计DCAD水平和实际测量值略有差异。

1.2 饲养管理

试验共持续47 d，前10 d观察山羊采食和健康状况，然后进入为期30 d的试验期。试验期分为2个阶段，每个阶段持续15 d。每个阶段的前10 d为预饲期，主要观察山羊采食MgSO4·7H2O的适应性，后5 d为采样期。每个阶段结束后，持续7 d采食对照饲粮，消除处理残留效应。试验期间羊舍保持干燥，自然通风，山羊单饲于代谢笼中，留有运动空间。日饲3次，饲喂时间分别为8:00、13:00、18:00。山羊自由采食和饮水。

1.3 指标检测

1.3.1 日粮常规养分与DCAD 自预饲期开始，每天采集饲粮样品，试验结束后混匀并制成分析样品，检测常规养分：粗蛋白质(Crude protein, CP)、中性洗涤纤维(Neutral detergent fiber, NDF)、酸性洗涤纤维(Acid detergent fiber, ADF)、粗灰分(Ash)、粗脂肪(Ether extract, EE)、钠(Na)、钾(K)、氯(Cl)、硫(S)。CP采用凯氏定氮法，NDF、ADF采用Van Soest法，EE采用乙醚浸提法，Ash采用灼烧法，氯(Cl)采用硝酸银滴定法(GB/T6439-92)测定，硫(S)含量采用硝酸镁法(GB/T17776-1999)测定[12]，钠(Na)、钾(K)含量采用原子吸收法测定(试剂盒购自北京三雄科技公司)。DCAD计算公式：DCAD(mmol/kg DM)=Na(%)/0.0023 + K(%)/0.0039-Cl(%)/0.00355-S(%)/0.0016。

表1 山羊日粮组成及营养水平(干物质基础)Table 1 Composition and nutrition levels for diets of goats(DM basis)

注：①组成及水平：玉米67% ，豆粕 7%，麦麸 11%，菜籽饼 11%，预混料 2%，碳酸氢钙 1%，食盐 1%。每kg预混料含：VA 300～500 IU,VD3 150～220 IU,VE 850 IU,Fe 1 500～5 000 mg,Cu 500～620 mg，Mn 1 500～4 000 mg，Zn 2 000～3 500 mg,I 50～200 mg，Se 10～20 mg，Co 20～40 mg，Lys 10 000 mg。

Notes:① Composition and nutritional level: corn 67%，soybean meal 7%, wheat bran 11%，rapeseed cake 11%，premix 2%，CaHPO41%，NaCl 1%。The premix per kg contains: VA 300～500 IU,VD3150～220 IU,VE 850 IU,Fe 1 500～5 000 mg,Cu 500～620 mg，Mn 1 500～4 000 mg，Zn 2 000～3 500 mg,I 50～200 mg，Se 10～20 mg，Co 20～40 mg，Lys 10 000 mg.

1.3.2 尿液pH 从每期正试期开始持续至试验结束，连续5 d，每天在采食2 h后用精密pH试纸(pH范围为5.4～7.0，6.4～8.0，上海试剂三厂)蘸取新鲜尿液与标准板比对，记录尿液pH，以此判定山羊尿液pH变化情况。

1.3.3 血液指标 晨饲前(7:00)用肝素抗凝管从颈静脉采血10 mL，3 000 r/min离心15 min，取上清血浆置于-20 ℃冰箱保存，试验结束后采用试剂盒法测定血浆Ca、甲状旁腺素(Parathyroid hormone, PTH)、降钙素(Calcitonin, CT)、1,25二羟基维生素D3(1,25-(OH)2VD3)、瞬时性受体电位通道香草酸受体亚型6(transient receptor potential vanilloid 6, TRPV6)、维生素D受体(VDR)。上述指标检测试剂盒均购自南京建成生物公司。

1.3.4 瘤胃发酵参数 采用胃管式瘤胃液采样器于晨饲前采取瘤胃液，4层纱布过滤后测定瘤胃液发酵参数，包括：瘤胃液pH、氨态氮浓度(NH3-N)。其中，瘤胃液pH用便携式pH计(梅特勒-托利多仪器FG2-ELK)测定，氨态氮浓度参照文献[13]方法测定。

1.4 数据统计

2 结果与分析

2.1 干物质采食量

处理组山羊干物质采食量在预饲期前3 d稍低，经适应后逐渐恢复至与对照组基本一致水平，对照组、处理组分别为940.8±3.85和932.3±6.76 g/d，差异不显著(P>0.05)，说明添加阴离子盐未对山羊饲粮适口性产生影响。

2.2 尿液pH

对照组和处理组山羊尿液pH分别为7.8±0.10和6.4±0.07，差异显著(P<0.05)，说明处理组山羊采食低DCAD水平饲粮后尿液明显酸化。

2.3 血浆代谢指标

由表2可知，处理组血浆Ca2+浓度高于对照组12.3%(P<0.05)。血浆VDR、TRPV6、PTH浓度变化与DCAD水平呈相反趋势，即DCAD水平降低，血浆VDR、TRPV6、PTH浓度升高。处理组VDR、TRPV6、PTH分别高于对照组17.2%、20.8%、30.4%(P<0.05)。两组1,25-(OH)2VD3、CT水平接近，差异不显著(P>0.05)。

2.4 瘤胃发酵参数

处理组的瘤胃液pH和NH3-N浓度分别为6.48±0.37和6.46±0.17，与对照组(分别为6.80±0.16和6.24±0.19)差异不显著(P>0.05)。

3 讨 论

3.1 不同DCAD水平日粮对山羊干物质采食量的影响

动物采食量与其生长发育和生产性能的密切相关，是评价降低DCAD水平是否适宜首要考虑的问题，与饲粮适口性、环境、饲养管理方式等因素有关[14]。DCAD为负值的日粮通常具有苦涩味，会造成干物质采食量下降[15]。本试验中，处理组山羊的干物质采食量未明显降低，说明山羊可适应本试验所用阴离子盐(MgSO4·7H2O)的味道。此结果得到前人研究报道的支持[16-18]，同时与本课题组前期的研究结果[19]一致。

表2 不同DCAD水平饲粮对山羊血钙及其代谢因子水平的影响Table 2 Effect of different DCAD levels of diets on blood calcium and its metabolism associated factors in goats

注：同行数据肩标为相同字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

Notes: In the same row, values with the same or no letter superscripts mean insignificant difference (P>0.05), while different lowercase superscripts mean significant difference (P<0.05).

3.2 不同DCAD水平日粮对山羊尿液pH的影响

采食低DCAD饲粮可诱导机体轻度代偿性酸中毒，DCAD水平与尿液pH及血液pH之间呈显著性相关[20]。尿液pH收集、测量便捷，对机体应激小，尤其对DCAD水平敏感性强，可作为量化DCAD水平的指标。试验表明，尿液pH会随DCAD降低而下降[21]，这是因为采食DCAD饲粮，根据强离子差理论，Cl-、S2-被机体吸收后，可在肾脏中产生相应的负电荷，机体为了维持溶液电中性和电离平衡而分泌排出相应的H+，使血液中的阴离子水平高于阳离子水平，从而导致尿液pH降低[22]。本试验中处理组尿液pH显著低于对照组，这与Goff和Horst[23]试验结果一致，其认为降低DCAD后尿液pH的理想数值为5.5～6.5，在这个范围可保证肾脏离子代谢不紊乱和较高的血钙水平。总体而言，降低DCAD水平，可使尿液pH降低。

3.3 不同DCAD水平对山羊瘤胃发酵参数的影响

3.3.1 瘤胃pH 瘤胃pH是食糜VFA与唾液缓冲盐相互作用、以及瘤胃上皮对VFA吸收及食糜排出等因素综合利用的结果，是反映瘤胃酸碱平衡状况和瘤胃微生物环境的重要指标。鉴于瘤胃pH绝对水平的重要性，Iwaniuk和Erdman[24]统计分析了DCAD水平与瘤胃pH的关联性，发现在0～550范围内，饲粮DCAD水平每升高100个单位，瘤胃pH仅上调0.03个单位，显示瘤胃pH变幅最大是0.165个单位。与精粗比不同引发瘤胃酸中毒后的瘤胃pH变异相比，这个变幅差异很小，不足以根本改变瘤胃发酵状态。

本试验中两组山羊的瘤胃pH仅有微小差异，处于正常范围，说明低水平DCAD饲粮未对瘤胃发酵产生负面影响。更进一步，本课题组前期研究发现，体内pH(饲喂低DCAD饲粮，DCAD=-111)、体外pH(以低DCAD饲粮作发酵底物，DCAD=-170)水平均在正常范围[25]。与此类似，李斌[26]发现饲喂低DCAD饲粮后pH在2～6 h短期内降低，但很快回升至正常水平，这可能与瘤胃液强大的缓冲能力有关；Murphy和Kennelly[27]也得出相同结论，他们指出瘤胃pH一般是在采食后2～6 h内降低。Tucker等[28]对泌乳奶牛研究结果显示，瘤胃pH水平随饲粮DCAD水平升高(-100、0、100、200)而呈现上升趋势，但瘤胃发酵模式未改变。张跃文等[29]在体外模拟瘤胃发酵试验中，饲粮DCAD水平由正值+120降为-150的几个梯度(梯度水平为-70)对瘤胃pH均未产生影响。上述结果表明，DCAD水平造成的瘤胃pH差异很小，对瘤胃发酵状态的影响可忽略不计，为研究后续发酵参数奠定了基础。

3.3.2 瘤胃发酵参数 瘤胃NH3-N水平是反映饲粮蛋白质在瘤胃中的降解、能量供给及微生物蛋白的合成的重要指标，主要受采食速度、饲粮含氮量、降解速度、唾液及瘤胃缓冲能力等因素的影响。瘤胃微生物合成MCP所需的NH3-N水平在0.35～29.0 mg/100 mL之间[30]。当饲粮含氮化合物的含量较大且易被降解，瘤胃降解速度大于瘤胃微生物的合成速度时，瘤胃内NH3-N浓度较高，此时瘤胃中NH3-N参与“瘤胃-肝脏的氮素循环”。本试验结果表明，处理组和对照组NH3-N水平均处于正常范围内。胡明等[31]研究发现，随饲粮DCAD水平增加(0、100、200、400)，瘤胃NH3-N变化范围为4.60～31.62 mg/100 mL。冯强等[32]将饲粮DCAD水平设为0、50、100、200，发现在同一时间点，随DCAD水平增加，瘤胃NH3-N浓度变化范围为7.72～30.80 mg/100 mL之内。这从另一侧面说明，DCAD水平不对瘤胃发酵产生负面作用。

瘤胃发酵作为反刍动物营养研究的重要内容，综合本试验上述指标测定结果和前人报道，可以认为，DCAD水平不会对瘤胃发酵和体内代谢产生负面影响。这为生产实践中推广添加阴离子盐降低DCAD防治低血钙提供了理论依据。

3.4 不同DCAD水平对山羊血浆指标的影响

3.4.1 血浆Ca2+水平 作为降低DCAD处理的主要观察点和效应表征，血钙水平是该类研究的重要检测指标。动物血钙稳恒由胃肠道Ca2+摄取、骨钙溶解及肾Ca2+重吸收等多种机制共同调节，一般维持在2.0～3.0 mmol/L范围间；低于2.0 mmol/L，即发生低血钙。本课题组前期研究报道，DCAD与血钙水平存在较强的关联度，DCAD降低，血钙水平升高；反之亦然[33]。这也在本试验中得到体现，并与该领域相关研究结果一致。Goff等[34]认为，不考虑饲粮钙水平的影响，饲粮 DCAD 为负值时，奶牛分娩时血浆中钙离子的浓度显著提高。Oba等[35]发现，对非泌乳非怀孕奶牛注射EDTA使其血钙降低后，饲喂不同DCAD水平(-64 vs. 82)和不同的钙水平(3.0和9.1 g/kg DM)饲粮，发现高钙饲粮和低DCAD水平饲粮均能缩短血钙水平恢复时间。总之，降低DCAD能提高血钙水平，得到学界的普遍认同，成为防治低血钙的常用措施。

3.4.2 钙调蛋白 PTH浓度是血钙调节的关键因素，一方面可促进肾脏对1,25-(OH)2VD3合成与分泌，二者可影响肾脏对Ca2+的重吸收；另一方面，PTH促进破骨细胞形成，抑制成骨细胞生成与转化，调控骨骼钙动员。1,25-(OH)2VD3是Ca2+主动转运的载体，可促进肠道上皮细胞对Ca2+的主动吸收。CT主要是抑制新的破骨细胞生成并使破骨细胞活性降低，从而降低血钙浓度。上述3种激素浓度的变化可反映血钙含量的变化。本试验结果显示，虽然两组山羊1,25-(OH)2VD3和CT水平变化不大，差异不显著；但处理组血浆PTH浓度显著高于对照组，这说明DCAD饲粮可促进PTH的分泌，可能贡献了较高的血钙水平。VDR是钙吸收过程中主要的调控因子，其与1,25-(OH)2VD3特异性结合为蛋白-受体复合物发挥生理功能[36]，同时，1,25-(OH)2VD3能有效提高胃肠道TRPV6的活性[37]。TRPV6大量分布于肠道上皮细胞，是促使胞内Ca2+跨质膜外排进入血液的重要生理大分子，也是肠道上皮细胞对Ca2+的吸收的初始元件；在Ca2+吸收过程中，TRPV6通道表达增加，使Ca2+内流速度加快、胞内Ca2+浓度增加。本课题组前期研究发现，低DCAD饲粮可提高山羊胃肠道VDR和血浆TRPV6的水平[38]。本试验结果显示，山羊血浆VDR、TRPV6的浓度随饲粮DCAD水平的降低而升高，并达到差异显著水平，提示DCAD饲粮对血浆VDR、TRPV6的浓度有上调作用。总体来看，降低DCAD后，虽然并非所有钙调因子浓度都增加，但血液PTH、VDR和TRPV6水平得以升高，使处理组山羊血钙水平高于对照组，更好地维持血钙稳恒状态。

4 结 论

低DCAD饲粮可降低山羊体内酸碱平衡状态，提高血钙及其代谢因子水平，对瘤胃发酵指标不产生负面影响。这为生产实践推广添加阴离子盐降低DCAD防治低血钙提供了理论依据。