血流感染中产CTX-M型ESBLs大肠埃希菌的分子流行病学和危险因素研究*

何建春，董 剑，杨 雷，裴昌贞

(重庆市大足区人民医院：1.检验科；2.睡眠心身中心，重庆 402360)

超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)主要由肠杆菌产生，是一种经质粒介导的能水解青霉素类和头孢菌素类等抗菌药物的新型广谱β-内酰胺酶[1-2]。ESBLs分为CTX-M型、TEM型、SHV型及其他型，而CTX-M型是ESBLs中最常见的型别[3]。产CTX-M型ESBLs-大肠埃希菌(E.coli)对大部分抗菌药物耐药，增加抗感染治疗难度，可引起患者住院时间延长、预后差和病死率上升等不良后果[4]。目前，我国产CTX-M型ESBLs-E.coli感染的相关流行病学和危险因素研究较少,因此，为了有效预防该类菌株的医院感染，本研究对血流感染中产CTX-M型ESBLs-E.coli的分子流行病学和危险因素进行了分析。

1 资料与方法

1.1菌株来源 回顾性收集本院2014年1月至2017年12月血流感染标本中首次分离的204株非重复E.coli(剔除分离自同一患者的重复菌株)。

1.2菌株鉴定及药敏试验 依据《全国临床检验操作规程》第3版进行血液标本微生物的分离、培养和纯化。将纯化后的菌株通过Vitek2 Compact全自动细菌鉴定系统进行鉴定，并采用配套药敏鉴定卡测定细菌对头孢曲松和头孢他啶等14种抗菌药物的最小抑菌浓度，参照CLSI M100-S26文件判读结果。

1.3ESBLs确证试验 依据CLSI M100-S26，确证试验通过双纸片协同试验完成。将检出的产ESBLs-E.coli运用头孢他啶(30 μg)、头孢他啶(30 μg)加克拉维酸(10 μg)、头孢噻肟(30 μg)、头孢噻肟(30 μg)加克拉维酸(10 μg)进行纸片扩散法验证；如在任一药敏纸片上加克拉维酸的抑菌圈直径与不加克拉维酸的抑菌圈直径之差≥5 mm，则判定该菌株产ESBLs。在204株E.coli中，共检出93株产ESBLs菌株，余下111株为非产ESBLs菌株。

1.4ESBLs基因检测 采用聚合酶链反应(PCR)检测ESBLs基因(blaTEM、blaSHV、blaCTX-M-1和blaCTX-M-9)[5]，共检出49株产CTX-M型ESBLs-E.coli作为CTX-M组，剩余44株非产CTX-M型ESBLs-E.coli作为非CTX-M组，111株非产ESBLs-E.coli作为对照组。

1.5产CTX-M型ESBLs-E.coli的同源性分析 采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)对随机选取的29株产CTX-M型ESBLs-E.coli 进行菌株同源性分析。PFGE包括菌栅胶的制备、溶菌和裂解、洗胶块、酶切、制作电泳胶、上样、电泳和获取图像等步骤[6]。

1.6临床资料采集 统计204例感染E.coli患者的临床资料，包括年龄和性别等基本资料；尿路感染、肺部感染和低蛋白血症等合并症；感染前手术史、机械通气和气管插管等侵入性操作情况；青霉素类、头孢菌素类和碳青霉烯类等抗菌药物的使用情况。

1.7统计学处理 使用SPSS22.0软件进行数据分析。计数资料以例数或百分率表示，组间比较采用χ2检验；采用Logistic回归分析进行危险因素分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1E.coli产ESBLs率和CTX-M型分布 2014年1月至2017年12月本院血流感染标本中共分离出204株E.coli，其中111株为非产ESBLs菌株，93株为产ESBLs菌株，产ESBLs率为45.6%。93株产ESBLs -E.coli中表达blaCTX-M 49株(52.7%)，blaTEM 38株(40.9%)和blaSHV 15 株(16.1%)。其中1株联合表达blaCTX-M、blaTEM和blaSHV，5株联合表达blaCTX-M和blaTEM，2株联合表达blaCTX-M和blaSHV。

2.2产CTX-M型ESBLs-E.coli的耐药率分析 CTX-M组对庆大霉素、阿米卡星、亚胺培南和美罗培南的耐药率与对照组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，其余抗菌药物在两组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。CTX-M组对庆大霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、头孢他啶和头孢吡肟的耐药率均高于非CTX-M组，差异有统计学意义(P<0.05)，其余抗菌药物在两组间比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 耐药率在CTX-M组、非CTX-M组与对照组中的分布情况[n(%)]

续表1 耐药率在CTX-M组、非CTX-M组与对照组中的分布情况[n(%)]

注：与CTX-M组比较，*P<0.05。

2.329株产CTX-M型ESBLs-E.coli的同源性分析 PFGE结果显示，随机选取的29株产CTX-M型ESBLs-E.coli属于不同的型别，来源不同，未发现克隆传播。见图1。

2.4产CTX-M型ESBLs-E.coli感染的单因素分析 单因素分析结果显示，与非CTX-M组比较，年龄≥60岁、男性、入住ICU、粒细胞减少症、肠外营养、内置引流管、头孢菌素类和喹诺酮类抗菌药物使用是CTX-M组患者感染产CTX-M型ESBLs-E.coli的危险因素(P<0.05);与对照组比较，入住ICU、转院、尿路感染、低蛋白血症、感染前手术史、置入导尿管、内置引流管、头孢菌素类及喹诺酮类抗菌药物使用是CTX-M组患者感染产CTX-M型ESBLs-E.coli的危险因素(P<0.05)。见表2。

注：1～29为29株产CTX-M型ESBLs-E.coli的菌株编号，分别为29个型别。

图1 产CTX-M型ESBLs-E.coli的PFGE结果

表2 产CTX-M型ESBLs-E.coli感染的单因素分析[n(%)]

续表2 产CTX-M型ESBLs-E.coli感染的单因素分析[n(%)]

2.5产CTX-M型ESBLs-E.coli感染的多因素Logistic回归分析 将单因素分析中P<0.05的变量纳入多因素Logistic回归分析模型，结果显示,与非CTX-M组比较，年龄≥60岁、粒细胞减少症、内置引流管和头孢菌素类抗菌药物使用是CTX-M组患者感染产CTX-M型ESBLs-E.coli的独立危险因素(P<0.05)，见表3。与对照组比较，转院、尿路感染、置入导尿管和头孢菌素类抗菌药物使用是CTX-M组患者感染产CTX-M型ESBLs-E.coli的独立危险因素(P<0.05)，见表4。

表3 CTX-M组与非CTX-M组多因素Logistic回归分析

表4 CTX-M组与对照组多因素Logistic回归分析

3 讨 论

E.coli是一种常见的医院感染条件致病菌，常引起血流感染等全身性感染。近年来因多种抗菌药物的广泛使用，使得E.coli的耐药率不断增加。产ESBLs(特别是CTX-M型ESBLs)是E.coli对β-内酰胺类抗菌药物最主要的耐药机制，能导致E.coli对头孢菌素类等多种抗菌药物产生耐药。本研究中，从产ESBLs菌株的耐药基因分布来看，CTX-M型最多，达到52.7%(49/93)，故本研究以CTX-M型作为研究对象。药敏试验结果显示，CTX-M组对庆大霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、头孢他啶和头孢吡肟的耐药率均高于非CTX-M组(P<0.05)，与国外相关报道一致[6]，可能是由于ESBLs的型别多样性及地区差异，使得CTX-M型与其他型别产ESBLs-E.coli对抗菌药物的耐药性存在差异[7]。从菌株同源性来看，29株产CTX-M型ESBLs-E.coli的PFGE条带不一，呈现出多样性，表明这些菌株来源不同，不存在菌株间克隆传播和暴发流行。

与非产CTX-M型ESBLs-E.coli感染患者比较，高龄、粒细胞减少症、内置引流管和头孢菌素类抗菌药物使用是感染产CTX-M型ESBLs-E.coli的独立危险因素。高龄患者常常由于基础疾病多使得其在感染时全身炎性反应能力降低，免疫防御功能差，定植菌转变成致病菌，从而增加产CTX-M型ESBLs-E.coli感染的机会；也有研究证明，CTX-M型菌多见于系统进化树中的D群，有天然致病的潜力，能有效避开宿主反应，容易在免疫力低下的宿主中造成感染[8]。当粒细胞减少时，患者体内不能在免疫球蛋白和补体参与下使细菌吸附于粒细胞膜上，粒细胞释放的溶菌酶等多种酶类不足以杀灭细菌，从而导致产CTX-M型ESBLs-E.coli感染。虽然内置引流管能够防止血肿和继发感染的发生，但也为E.coli发生逆行性感染提供了通道，从而增加了血流感染的概率。因此，临床应重视和加强高龄和粒细胞减少症患者的细菌培养，并及早进行治疗。对引流患者应尽早拔除引流管，加强伤口护理，从而减少感染的发生、发展。

与非产ESBLs-E.coli感染患者比较，转院、尿路感染、置入导尿管和头孢菌素类抗菌药物使用是产CTX-M型ESBLs-E.coli感染的独立危险因素。转院为独立危险因素可能与患者在转入本院前就已经携带了产CTX-M型ESBLs-E.coli有关。置入导尿管为独立危险因素的原因可能与以下相关：导尿能导致人体尿道机械性损伤，毁坏机体的免疫屏障，削弱机体保护、防御功能，E.coli及人体分泌物同时黏附在导尿管内壁，并覆盖在生物膜或黏糖复合物内而不能及时被清除和被抗菌药物杀灭，增加了感染的可能性[9]。当患者发生尿路感染时，尿液中的E.coli可通过尿道上行而引发血流感染。

与非CTX-M组和对照组比较，头孢菌素类抗菌药物使用是发生产CTX-M型ESBLs-E.coli感染的共同独立危险因素，提示在头孢菌素类抗菌药物的刺激下，E.coli更容易产生CTX-M型ESBLs，其可能原因是E.coli为了躲避头孢菌素类抗菌药物的杀灭，发生基因突变产生CTX-M型别。而相关报道发现，CTX-M型ESBLs已有5组120多种亚型，且5组之间同源性低，所以菌株更趋向于产生CTX-M型ESBLs[10]。还有研究发现，在头孢菌素类抗菌药物的刺激下，产CTX-M型ESBLs菌株能够通过质粒水平传播给非产ESBLs菌株，从而引起产CTX-M型ESBLs-E.coli的流行[11-13]。

4 结 论

产CTX-M型ESBLs-E.coli血流感染的发生率及菌株耐药率均较高，使用头孢菌素类抗菌药物是产CTX-M型ESBLs-E.coli感染的独立危险因素。临床可通过减少侵入性操作、合理使用抗菌药物等方法来减少产CTX-M型ESBLs-E.coli感染的发生率。