ApoE基因rs429358和rs7412位点基因多态性与喀什地区维吾尔族人群尿道结石的关系研究*

张 媛，侯 丽，杨 帆，邝 辉△

(1.新疆维吾尔自治区喀什地区第二人民医院检验科，新疆喀什 844000；2.新疆医科大学第一附属医院检验科，新疆乌鲁木齐 830000；3.同济大学附属同济医院检验科，上海 200333)

尿道结石作为泌尿系统最常见的疾病，其发病人数逐年递增[1]。目前，尿道结石诊断主要依靠CT等影像学检查，缺少相关的实验室诊断标志物，大多数患者确诊时病情已较严重。寻找灵敏度、特异度高的诊断标志物，用于早期诊断，对尿道结石的治疗及预防具有重要意义[2]。尿道结石的发病除了与生活方式、饮食习惯有关外，还与遗传因素密切相关。有研究报道，尿道结石的发病呈现一定的地域和种族差异，喀什地区尿道结石发病率较高，考虑与该地区地理位置和维吾尔族人群的种族特异性有关[3]。载脂蛋白E(ApoE)是一种由肝脏合成的富含精氨酸的碱性蛋白，主要参与机体脂代谢过程。有研究证实，ApoE基因多态性是影响脂代谢紊乱的重要因素之一，而脂代谢紊乱又参与了尿道结石的发生、发展[4-5]。本研究探讨了喀什地区维吾尔族尿道结石患者ApoE基因rs429358和rs7412位点的基因多态性分布情况及其与尿道结石发生的关系，旨在为临床尿道结石的诊疗及预防提供参考依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取喀什地区第二人民医院泌尿外科2016年6月至2018年6月收治的维吾尔族尿道结石患者216例作为观察组，其中男127例，女89例；年龄24～70岁，平均(42.52±11.35)岁。纳入标准：B超、CT等影像学检查确诊为尿道结石；患者父母均为维吾尔族；临床资料完整。排除标准：合并其他恶性肿瘤；合并高血压等心脑血管疾病；合并泌尿系统感染、尿路畸形等。选取216例同期体检的维吾尔族健康者作为对照组，其中男119例，女97例；年龄23～71岁，平均(43.62±10.73)岁。两组性别、年龄等一般资料比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经喀什地区第二人民医院伦理委员会批准。

1.2方法

1.2.1DNA提取及检测 所有研究对象清晨空腹采集静脉血4 mL，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝后，根据DNA试剂盒(上海生工生物工程股份有限公司)说明书提取DNA；提取完成后检测DNA纯度，水平>20 ng/μL，且A260/A280为1.7～1.9；采用双蒸水调整DNA水平至50 ng/μL后-20 ℃保存备用。

1.2.2PCR扩增及测序 rs429358和rs7412引物序列如表1所示，扩增片段长度分别为240 bp和498 bp。反应体系包括TaqDNA聚合酶2 μL，2.5 mmol/L dNTP 2 μL，20 mmol/L正向引物和反向引物各0.4 μL，DNA模板0.5～0.6 μL，加无菌去离子水至总反应体积为30 μL。反应条件：95 ℃预热3 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火35 s，72 ℃延伸40～50 s；循环30次后再延伸10 min。PCR 扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，并于测序仪上完成测序。测序方法：根据高分辨熔解曲线分析的不同曲线和酶切片段大小、数量确定不同的基因型，产物rs429358序列长度为238 bp，rs7412序列长度为384 bp。

表1 rs429358和rs7412引物序列

注：F为正向引物，R为反向引物。

1.2.3ApoE基因多态性分析 取PCR产物1 μg进行ApoE酶切反应,酶切体系:10×缓冲液2 μL，ApoE内切酶5 μL，DNA 1 μL，加无菌水至总反应体积为20 μL；反应条件为37 ℃ 4 h；酶切终止后采用聚丙烯酰胺凝胶，90 V电压，电泳2 h，然后用凝胶图像分析系统分析基因型。

1.2.4血脂相关指标水平检测 所有研究对象清晨空腹采集静脉血3～5 mL，分离血清待测。于贝克曼Au5800全自动生化分析仪上进行总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、载脂蛋白A(ApoA)、载脂蛋白B(ApoB)及ApoE水平检测。

2 结 果

2.1Hardy-Weinberg平衡检验 对两组研究对象ApoE基因rs429358和rs7412位点的基因型分布进行Hardy-Weinberg平衡检验，结果显示，均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，所纳入的研究对象具有人群代表性。见表2。

2.2ApoE基因rs429358和rs7412位点基因型及等位基因频率比较 观察组ApoE基因rs429358位点TT、TC基因型频率分别为70.83%和29.17%，T、C等位基因频率分别为85.42%和14.58%，与对照组基因型频率和等位基因频率比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。ApoE基因rs429358位点TC基因型携带者患尿道结石的风险较TT基因型增加(OR=2.75，95%CI=1.24～6.02)，T等位基因携带者患尿道结石的风险较C等位基因增加(OR=2.19,95%CI=1.30～5.64)。观察组ApoE基因rs7412位点TT、TC、CC基因型频率分别为1.85%、12.96%和85.19%，T、C等位基因频率分别为8.33%和91.67%，与对照组基因型频率和等位基因频率比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3。

2.3两组血脂相关指标水平比较 观察组TG、TC、LDL-C及ApoE水平均高于对照组，HDL-C水平低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；ApoA和ApoB水平在两组间比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表2 ApoE基因rs429358和rs7412位点Hardy-Weinberg平衡检验

表3 ApoE基因rs429358和rs7412位点基因型及等位基因频率比较[n(%)]

表4 两组血脂相关指标水平比较

3 讨 论

尿道结石具体的发病机制目前尚不明确，有学者认为生活方式、饮食习惯、地域差异及遗传因素在尿道结石形成过程中发挥着重要作用[6]。新疆维吾尔自治区是尿道结石的高发地区，该地区维吾尔族人群由于生活方式和饮食习惯与汉族人群有着较大差异，其尿道结石的发病率及复发率明显高于汉族人群[3]。喀什地区位于新疆维吾尔自治区南部，该地区维吾尔族人群日常饮食以面食和牛羊肉为主，加上常年食用奶制品与茶点，摄入高脂肪和高蛋白食物较多，导致脂代谢紊乱在该地区发病率较高；而相关研究证实，脂代谢紊乱与尿道结石的发生、发展有关[4-5]。血脂水平升高与ApoE基因表型相关[7-8]，喀什地区维吾尔族人群ApoE基因多态性是否与尿道结石的发生有关，健康人群与尿道结石患者ApoE基因型及等位基因的差异是否对尿道结石的诊断有一定的价值，目前少有报道。因此，本研究对此进行了深入探讨，以期为尿道结石的诊疗及预防提供参考。

叶炳华等[8]、宋雨等[9]报道了国内汉族人群ApoE基因rs429358和rs7412位点包含多种基因型和等位基因，且人群间等位基因和基因型分布存在一定的差异。本研究中，观察组ApoE基因rs429358位点TT、TC基因型频率和T、C等位基因频率与对照组比较有明显差异，且TC基因型携带者患尿道结石的风险较TT基因型增加(OR=2.75,95%CI=1.24～6.02)，T等位基因携带者患尿道结石的风险较C等位基因增加(OR=2.19,95%CI=1.30～5.64)。提示TT、TC基因型和T、C等位基因的差异可能是导致喀什地区维吾尔族人群患尿道结石的可能原因，同时TC基因型、T等位基因可能分别是导致尿道结石的高风险基因型与等位基因。

本研究中，观察组ApoE基因rs7412位点TT、TC、CC基因型频率和T、C等位基因频率与对照组无明显差异，与吴计超[10]对广西壮族人群的研究结果类似，提示ApoE基因rs7412位点基因型与基因频率可能与尿道结石的发病无关。

王艳梅等[11]、梁爱芬等[12]的研究指出，心血管疾病患者血脂水平与ApoE基因多态性密切相关，ApoE基因rs429358位点突变患者血脂水平升高，且心脑血管事件的发生风险也明显升高。本研究中，观察组TG、TC、LDL-C及ApoE水平均高于对照组(P<0.05)，HDL-C水平低于对照组(P<0.05)，进一步证实了ApoE基因多态性与脂代谢紊乱有关，从而增加了尿道结石的发病风险。

4 结

喀什地区维吾尔族人群ApoE基因rs429358位点是尿道结石的易感基因位点，其可能通过对血脂水平的影响从而使尿道结石的发生风险增加，可成为尿道结石早期预防和治疗的潜在生物标志物。