多参数流式细胞术检测儿童急性B淋巴细胞白血病免疫表型与预后分析*

张 霞，付笑迎，覃文琪，李济填，周 杰，刘新刚△

(1.深圳大学总医院检验科，广东深圳 518000；2.广东省深圳市儿童医院检验科，广东深圳 518055)

急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)发病率约占急性淋巴细胞白血病(ALL)的85%，是儿童最常见的肿瘤[1-2]。B-ALL恶性肿瘤细胞抗原的表达具有高度异质性，其诊断依赖于白血病相关免疫表型(LAIP)。近年来，多参数流式细胞术已广泛用于LAIP检测，为B-ALL的诊断、分型及微小残留病灶(MRD)的监测提供了有力的帮助[3-4]，而LAIP的存在是多参数流式细胞术监测MRD的基础[5]。本研究分析了儿童B-ALL免疫表型特点，结合患儿预后，探讨了免疫表型在不同预后中的差异，有助于预测疾病和指导临床个体化治疗。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2015年10月至2017年12月在深圳市儿童医院诊断及治疗的B-ALL患儿120例为研究对象，其中男69例，女51例，年龄2～4岁。所有患儿均依据MICM分型标准明确诊断为B-ALL。其中细胞遗传学异常患儿45例，包括TEL-AML1融合基因27例，E2A-PBX1融合基因7例，BCR-ABL融合基因6例，MLL-AF4融合基因2例，MLL-AF10融合基因1例，MLL-ENL 融合基因1例，TLS-ERG融合基因1例。依据CCLG-ALL-2008化疗方案MICM危险度分级标准进行危险度分级，其中低危15例，中危78例，高危27例。本研究经深圳市儿童医院医学伦理委员会批准，患儿家属均知情同意(法定监护人签署知情同意书)。

1.2多参数流式细胞术检测 采用肝素抗凝管抽取患儿2～4 mL骨髓标本，24 h内进行检测。骨髓标本通过细胞计数后，取(1～2)×105个有核细胞于流式测定管中。所用的荧光抗体标记物包括BD Horizon V500、异硫氰酸荧光素(FITC)、别藻青蛋白(APC)、藻红蛋白(PE)、多甲藻黄素叶绿素蛋白复合物(PerCP)、PerCP-Cy5.5、PE-Cy7、APC-Cy7、BD Horizon V450。单克隆抗体包括CD45、淋巴细胞系相关抗体(CD19、CD10、CD20、CD22、CD9、CyCD79a、CD58、SmIgM、CyIgM、TdT、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8)、髓系和干/祖细胞系相关抗体(CD13、CD64、CD14、CD15、CD33、CD117、CD66c、CD11b、CD34、CD38、HLA-DR、CD123、cMPO)及同型对照IgG等。以上抗体购自美国Becton Dickinson公司及Beckman Coulter公司。流式管中加入抗凝标本后根据试剂说明书加入抗体，充分混匀后，室温(18～25 ℃)下避光孵育15 min；加入溶血素充分混匀，避光放置10 min，1 300 r/min离心5 min，弃去上清液；加入磷酸盐缓冲液(PBS)充分混匀，以300×g离心5 min，弃去上清液；加入500 μL PBS混匀后用FACS Canto Ⅱ流式细胞分析仪(美国Becton Dickinson公司)进行检测。采用FACSDiva Version7.0软件进行标本分析。初诊时免疫分型至少记录1×104个有核细胞。胞浆或胞核抗原表达阳性率≥10%为阳性，其他抗原表达阳性率≥20%为阳性。

1.3ALL免疫表型判断标准 参考2016年版世界卫生组织(WHO)淋巴组织肿瘤分类，B-ALL判断标准：CD19+和(或)CyCD79a+、CD22+；急性T淋巴细胞白血病判断标准：CD7+、CD2+/-、CyCD3+、CD3+/-。B-ALL按免疫表型又分为早前B-ALL(CD19+、CD10-、CD34+、CyIgM-、SmIgM-)、普通B-ALL(CD19+、CD10+、CD34+、CyIgM-、SmIgM-)、前B-ALL(CD19+、CD10+/-、CD34-、CyIgM+、SmIgM-)和成熟B-ALL(CD19+、CD10+/-、CD34-、SmIgM+)。

1.4治疗方案 所有患儿均采用CCLG-ALL-2008化疗方案进行治疗。根据不同危险度分级予以相对应的强度方案及药物剂量。具体包括，(1)诱导缓解治疗：VDLD方案；(2)早期强化治疗：CAM 方案；(3)巩固治疗：低、中危使用HD-氨甲蝶呤(MTX)+6-MP方案，高危使用HR-1、HR-2、HR-3方案；(4)延迟强化治疗：VDLD、CAM方案；(5)维持治疗：6-MP+MTX等。定期鞘内注射预防中枢神经系统白血病。于化疗后第15天、第33天、第12周分别进行骨髓、外周血细胞形态学及MRD检测。

1.5疗效评价标准 疗程结束后，所有患儿随访至2018年6月，然后根据《血液病诊断及疗效标准》进行疗效评价，完全缓解(CR)：骨髓中幼稚淋巴细胞比例<5%；部分缓解(PR)：骨髓中幼稚淋巴细胞比例为5%～<25%；未缓解(NR)：骨髓中幼稚淋巴细胞比例≥25%。

1.6统计学处理 采用SPSS20.0软件进行数据分析。计数资料以例数或百分率表示，组间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1B-ALL各亚型分类结果 患儿初诊时根据多参数流式细胞术所检测的免疫表型进行亚型分类，在120例B-ALL患儿中，早前B-ALL 5例(4.2%)，普通B-ALL 75例(62.5%)，前B-ALL 35例(29.2%)，成熟B-ALL 5例(4.2%)。

2.2淋巴细胞系相关抗原在不同B-ALL亚型患儿中的阳性率 120例B-ALL患儿中，CD19阳性率最高，为100.0%，其他淋巴细胞系相关抗原主要为CD10、TdT、CyCD79a、CD9、CD22、CD58，阳性率依次为95.8%、94.2%、91.7%、81.7%、80.8%、64.2%。1例早前B-ALL和1例普通B-ALL患儿CD2、CD7表达阳性，其他亚型均未见T淋巴细胞系相关抗原表达。不同B-ALL亚型患儿CD22、CD9、CyCD79a、TdT阳性率差异均无统计学意义(P>0.05)；CD58阳性率差异有统计学意义(P<0.05)，其中普通B-ALL CD58阳性率最高(72.0%)。CD20只表达于普通B-ALL和前B-ALL，在早前B-ALL和成熟B-ALL中不表达；5例成熟B-ALL表达SmIgM。见表1。

2.3髓系和干/祖细胞系相关抗原在不同B-ALL亚型患儿中的阳性率 120例B-ALL患儿中，有87例(72.5%)患儿表达髓系相关抗原，阳性率由高到低依次为CD33(59.2%)、CD66c(40.8%)、CD13(30.0%)、CD15(6.7%)；B-ALL中均未见髓系相关抗原CD117、CD14表达。早前B-ALL、普通B-ALL、前B-ALL和成熟B-ALL髓系相关抗原阳性率分别为80.0%(4/5)、78.7%(59/75)、57.1%(20/35)、80.0%(4/5)，差异无统计学意义(P>0.05)。干/祖细胞系相关抗原CD34、CD38、HLA-DR、CD123、CD64在B-ALL中表达，其阳性率分别为79.2%、90.0%、99.2%、60.0%、0.8%；CD34的表达最常见于早前B-ALL(100.0%)和普通B-ALL(85.3%)。不同B-ALL亚型患儿干/祖细胞系相关抗原阳性率差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表1 淋巴细胞系相关抗原在不同B-ALL亚型患儿中的阳性率[n(%)]

表2 髓系和干/祖细胞系相关抗原在不同B-ALL亚型患儿中的阳性率[n(%)]

续表2 髓系和干/祖细胞系相关抗原在不同B-ALL亚型患儿中的阳性率[n(%)]

2.4免疫表型与预后的关系 对120例B-ALL患儿的随访资料分析显示，CR患儿85例，NR患儿35例，无PR患儿。不同B-ALL亚型患儿疗效比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。B-ALL髓系相关抗原阳性患儿CR率为65.5%，低于髓系相关抗原阴性患儿(84.8%)，差异有统计学意义(P<0.05)，见表4。CD34阳性患儿CR率为65.3%，低于CD34阴性患儿(92.0%)，差异有统计学意义(P<0.05)，见表5。

表3 不同B-ALL亚型患儿疗效比较[n(%)]

表4 髓系相关抗原阳性与阴性B-ALL患儿疗效比较[n(%)]

表5 CD34阳性与阴性B-ALL患儿疗效比较[n(%)]

3 讨 论

血液病的诊断依赖于细胞形态学、免疫学、细胞遗传学和分子生物学，即MICM分型。流式细胞术因具有快捷、灵敏、定量和应用广泛等特点，已成为白血病免疫表型和MRD检测的主要方法之一。ALL是儿童恶性肿瘤中最常见的类型，随着白血病诊断技术的不断提高及化疗方案的改进，如今ALL患儿的5年无事件生存率可达90%[6-7]。儿童ALL疗效的显著提高主要依赖于个体化治疗，尤其是根据危险度分级和早期调整化疗方案[8]。特殊免疫表型与临床预后相关，采用多参数流式细胞术检测ALL免疫表型，结合临床预后，可为临床危险度分级提供依据[9]。

本研究120例B-ALL患儿中，危险度分级中危患儿78例，所占比例最高(65.0%)，这与代庆凯等[10]的研究结果一致。在不同B-ALL亚型中，普通B-ALL患儿占比最高(62.5%)，其次为前B-ALL(29.2%)。B-ALL患儿细胞遗传学异常以TEL-AML1融合基因(27例)最为常见，其次为E2A-PBX1和BCR-ABL融合基因，分别为7例和6例，这与徐一卓等[11]的研究结果一致。本研究所有B-ALL患儿均表达CD19，其他淋巴细胞系抗原CD10(95.8%)、TdT(94.2%)、CyCD79a(91.7%)、CD9(81.7%)、CD22(80.8%)的阳性率也均较高，与赵雪飞等[12]的报道一致。本研究显示，CD58在不同亚型B-ALL间的阳性率存在差异，在普通B-ALL中阳性率最高(72.0%)。CD58作为淋巴细胞系相关功能抗原，其表达差异可能与B淋巴细胞系前体细胞发育过程中CD58分子出现的早晚有关。120例B-ALL患儿均未见CD3、CD4、CD5、CD8抗原表达，仅1例早前B-ALL和1例普通B-ALL患儿表达CD2、CD7，这与王晓雪等[13]的研究结果基本一致。B-ALL患儿表达T淋巴细胞系相关抗原是否与临床预后相关，有待进一步扩大样本量进行研究。

一般认为伴髓系相关抗原表达的ALL起源于比淋巴细胞系定向干/祖细胞更原始的干细胞。本研究显示，120例B-ALL患儿髓系相关抗原阳性率为72.5%，其中CD33阳性最为常见，其次为CD66c、CD13、CD15，与马琼等[14]的报道一致，与杨硕等[9]的报道不一致，这可能与使用的单克隆抗体、阳性判断标准及研究方法不同有关。不同B-ALL亚型间髓系相关抗原阳性率差异无统计学意义(P>0.05)，可能与髓系相关抗原作为LAIP在B淋巴细胞系前体细胞发育过程中本身不表达有关。本研究干/祖细胞系相关抗原CD34、CD38、HLA-DR、CD123在B-ALL中的阳性率也较高，与陈敬潮等[15]的报道一致。不同B-ALL亚型干/祖细胞系相关抗原阳性率差异无统计学意义(P>0.05)，可能与ALL由共同的淋巴细胞系祖细胞克隆性扩增及白血病细胞相关抗原的表达异质性相关。

本研究对120例患儿的随访数据分析发现，不同B-ALL亚型患儿疗效比较，差异无统计学意义(P>0.05)，提示存在于不同B-ALL亚型间的免疫表型差异与疾病预后无关。代庆凯等[10]研究发现，诱导缓解治疗结束时MRD的免疫表型可能与初发白血病时的免疫表型有差异，但这种抗原表达的改变与预后无关，而可能与治疗过程中动态监测MRD，并进行危险度评估，及时调整治疗方案有关，本研究结果也存这种可能。有学者认为，髓系相关抗原阳性的ALL预后差，然而目前大多数观点认为髓系相关抗原的表达与疾病预后无关[16]。本研究结果显示，髓系相关抗原阳性和阴性的B-ALL 患儿CR率比较，差异有统计学意义(P<0.05)，与大多数研究结果不符，可能与分析的样本量及化疗方案的不同导致的研究结果差异有关。CD34是造血干细胞的特异性标志物，既往研究指出，在白血病患者中CD34阳性率高于90%，尤其是在髓系白血病M1和M2型中，但在M3型等较为成熟的白血病细胞中阳性率较低，因此推测CD34表达与白血病低分化型有关[17]。据报道，ALL患者中，CD34阳性白血病细胞与CD34阴性白血病细胞相比，更不易凋亡，本研究CD34阴性患儿较CD34阳性患儿疗效更佳，可能与CD34阳性白血病细胞分化程度更低，细胞更不易凋亡有关。

4 结 论

B-ALL各亚型间免疫表型存在差异，分析B-ALL患儿免疫表型特点并进行预后评估，有助于预测特殊性的免疫表型在B-ALL预后中的意义，为B-ALL患儿的危险度分级及个体化治疗提供依据。