新型冠状病毒肺炎的实验室分子诊断及生物安全

邓少丽，刘 丁

(陆军特色医学中心：1.检验科;2.疾病预防控制科，重庆 400042)

新型冠状病毒肺炎(COVID-19)是指由新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染导致的病毒性呼吸道疾病。我国科学家从SARS-CoV-2感染者的支气管、肺泡灌洗液标本中检测出泛β-冠状病毒核酸阳性，并利用Illumina二代测序和Nanopore三代测序技术获得了病毒的全基因序列。随后，国内各种核酸检测试剂盒相继面世，主要包括实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、恒温扩增技术及快速卡式荧光PCR技术等。目前，RT-qPCR成为SARS-CoV-2核酸检测的主流方法。随着分子诊断的广泛开展，SARS-CoV-2实验室分子诊断的灵敏度、特异度及实验室生物安全等问题成为研究的焦点。进一步规范检测技术，确保实验室生物安全是做好疫情防控工作的前提和保障。笔者根据多年的实验室工作经验，结合抗击非典型肺炎、埃博拉病毒及COVID-19等工作经历，从以下几方面进行系统阐述，以期为临床实验室病原体核酸检测及生物安全提供参考。

1 病例定义

1.1疑似病例 疑似病例大多有流行病学史，如在发病前14 d内有武汉市及周边地区或其他有病例报告社区的居住史或旅行史；发病前14 d内与SARS-CoV-2检测阳性者有直接接触史；发病前14 d内曾接触过来自武汉市及周边地区或其他有病例报告社区的发热或呼吸道感染症状患者；聚集性发病。针对疑似病例，可对其进行流行病学史询问，并结合临床表现进行综合分析。临床表现主要包括：发热或呼吸道感染症状；具有COVID-19的影像学特征；白细胞计数正常或降低，淋巴细胞计数降低。具有上述流行病学史中的任何1项，同时符合临床表现中的2项者，则可定为疑似病例[1]。

1.2确诊病例 具有实验室分子诊断的病原学证据，确认为SARS-CoV-2核酸阳性的患者即可诊断为确诊病例[2]。实验室分子诊断主要包括：RT-qPCR检测SARS-CoV-2核酸阳性；病毒基因测序发现与已知的SARS-CoV-2高度同源；除鼻咽拭子外，采集其他体液、分泌物进行病毒核酸检测结果阳性[1]。目前，RT-qPCR检测病毒核酸是实验室确认的首选方法。血清SARS-CoV-2特异性IgM抗体和IgG抗体阳性也可作为病原学证据，对病毒核酸检测进行有效补充[3]。

1.3可能病例 除了确诊病例和疑似病例的定义外，从实验室诊断的角度，笔者建议需要设置可能病例。可能病例可定义为有明确流行病学史和临床症状，但RT-qPCR检测结果阴性。按照国际应对埃博拉病毒、中东呼吸综合征冠状病毒的惯例，设置可能病例可减少核酸检测假阴性引起的漏诊[4]。同时，建议对可能病例进行SARS-CoV-2核酸重复检测。

此外，对于接触过COVID-19确诊病例，且未进行有效防护的人群，也应纳入分子检测中。主要包括以下情况：与确诊病例共同生活；对COVID-19患者提供医疗诊治、护理时存在相关暴露；与确诊COVID-19的医护人员一起工作；直接接触过确诊病例的呼吸道分泌物者等。

2 临床实验室检测

鉴于现阶段SARS-CoV-2感染仍在流行，为更好地开展核酸检测工作，各医疗机构临床实验室应在确保生物安全和检测质量的前提下开展RT-qPCR，用于临床COVID-19诊断。RT-qPCR核酸检测的适应证包括:(1)用于确诊疑似病例;(2)筛查有流行病学史的人群;(3)鉴别诊断发热、社区获得性肺炎及急性呼吸窘迫综合征患者等。同时建议实验室也应该检测其他呼吸道相关病原体，如流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒等，但不应该因为增加检测项目而延误对SARS-CoV-2的及时检测。

2.1标本类型和标本采集 SARS-CoV-2检测的标本类型包括呼吸道标本、血液标本、消化道标本[1]。呼吸道标本包含鼻咽拭子、口咽拭子、鼻咽抽取物、深咳痰液、支气管灌洗液、肺泡灌洗液等，见表1。由于SARS-CoV-2造成的是下呼吸道感染，对患者而言，深咳痰液和支气管、肺泡灌洗液等下呼吸道标本为核酸检测首选[5]。但由于临床取样困难，目前核酸检测常用标本为鼻咽拭子和口咽拭子，但重症病例应优先采集下呼吸道标本，如深咳痰液和支气管、肺泡灌洗液。上呼吸道标本的采集十分重要，合格的标本是检出的关键。鼻咽拭子和口咽拭子标本应分别从鼻咽壁和口咽壁正确采集，以提高检测阳性率，而不是简单地从鼻孔或口腔采集。在标本收集中，可将鼻咽拭子和口咽拭子置于同一病毒保存液中。为保证病毒核酸的稳定性及检测的灵敏度，建议选用带塑料杆的合成纤维植绒拭子，不宜使用海藻酸钙拭子或木杆拭子，因为其可能含有灭活病毒和抑制PCR反应的物质。对于无症状者，诱导排痰或强迫咳痰有助于收集下呼吸道标本。在诊断标准中，血液标本也可用于检测SARS-CoV-2，但在临床检测中其阳性率低，不建议作为SARS-CoV-2筛查的常规检测标本。

表1 SARS-CoV-2检测的标本类型、容器与保存液及转运条件

在对有症状的确诊、疑似或可能病例进行常规标本采集时，采集人员应严格按照中国国家卫生健康委员会《新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南》的要求，个人防护装备包括N95及以上的防护口罩、护目镜、连体防护服、双层乳胶手套、防水靴套[1]。如果接触患者血液、体液、分泌物或排泄物时，应及时更换外层乳胶手套。此外，当气管插管、支气管或肺泡灌洗、咳痰等气溶胶暴露时，应加戴正压头套或全面型呼吸防护器。采集人员除需熟练掌握个人防护用品的使用技能外，还需经当地疾病预防控制中心或所在医疗机构的相关标本采集培训。门诊和住院患者由所在医院医护人员负责采集；密切接触者标本由当地疾病预防控制中心采集。采集过程最好在配有负压通风系统或每小时6～12次换气的常压隔离单人间内进行。严格限制参与采集工作的医护人员人数，避免不必要的接触。采集人员在接触患者前后，以及在脱卸个人防护用品的每一步骤前后，均应严格进行手卫生。采集结束后，做好环境清洁与消毒工作，层流房间空气自净30 min，普通房间用紫外线消毒。

2.2标本的包装与运输 对于医疗机构的内部运送，可采用双层包装系统。所有标本必须先用带螺旋盖的防漏塑料主容器包装，并用75%乙醇擦拭消毒容器表面，再用可重复、密封、抗压的二次容器包装，消毒后安全运送至实验室。随行标本中应有准确的标签或条形码，包括至少2个标识的患者身份信息，以避免标本混乱和污染。对于机构外的运送，则必须按照生物安全的需要，使用三重包装系统的生物安全运送箱；一重包装与医院内部运送相似，所有标本必须用双层容器包装；二重包装容器中应装有相关的信息表，如申请表格或三重包装容器中的信息表格；每重包装都需严格消毒，防止对外部环境及人员的污染。标本的容器与保存液、转运条件见表1。

2.3标本处理和核酸提取 标本应尽快检测，检测前建议56 ℃ 45 min灭活。若在24 h内检测，可置于4 ℃保存；若24 h内无法检测，则置于-70 ℃或以下保存。SARS-CoV-2 RNA的提取应根据实验室条件、试剂盒说明书要求，采用适当的人工或自动核酸提取方法，主要的核酸提取方法有磁珠法、离心柱法和一步裂解释放法。从痰液、粪便、鼻咽拭子、口咽拭子或血液中提取核酸，应根据仪器或试剂盒制造商的说明书进行。RNA标本应储存在-70 ℃或更低的温度中。

2.4SARS-CoV-2的分子检测及结果判读 建议使用RT-qPCR对SARS-CoV-2的RNA进行分子检测。推荐选用SARS-CoV-2的开放读码框1ab(ORF1ab)、核壳蛋白(N)及包膜蛋白(E)基因作为检测靶标，并提供阳性对照和内标。实验室确认阳性病例需满足以下2个条件中的1个[1]：(1)同一份标本中SARS-CoV-2 2个靶标(ORF1ab、N或E)RT-qPCR检测结果均为阳性；如果出现单个靶标阳性的检测结果，则需要重新采样，重新检测；如果重新检测结果仍然为单个靶标阳性，则可判定为阳性。(2)2种类型标本RT-qPCR检测结果同时出现单个靶标阳性或同种类型标本2次采样检测中均出现单个靶标阳性的结果，可判定为阳性。

结果判读的第一步是验证内控。内控阴性表明扩增过程失败，可能是由于存在PCR抑制剂或其他原因。在这种情况下，为了消除抑制作用，需要对处理后的同一标本进行重新检测，包括重新提取或稀释提取的核酸。在疑似病例中获得不确定的结果时，应立即向医院的感染控制部门报告。核酸检测结果阴性不能排除SARS-CoV-2感染，需要排除可能产生假阴性的因素，包括标本质量差，标本采集得过早或过晚，没有正确的保存、运输和处理标本，技术本身存在的原因，如病毒变异、PCR抑制等。若有明确接触史的病例出现多次阴性结果，且不应排除SARS-CoV-2感染时，应通过采集其他部位的标本(特别是下呼吸道标本)来进一步检测；也可将标本送至其他有资质的单位进行检测确认[6]。以靶标ORF1ab、N为例，SARS-CoV-2核酸检测结果判读流程见图1。

图1 SARS-CoV-2核酸检测结果判读流程图

3 实验室生物安全

对于疑似、确诊或可能病例的临床标本，诊断工作和RT-qPCR检测应在具有BSL-2设施的临床实验室进行。按照《新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南》要求，应穿戴适当的个人防护装备，所有技术程序都应在现有认证的Ⅱ类生物安全柜中进行，尽量减少气溶胶和液滴的形成[1]。完成检测工作后，用75%的乙醇消毒工作空间，去除所有个人防护用品。在离开实验室之前，无论何时摘除个人防护用品，手卫生都是必要的。根据医疗废物的立法规定，所有的医疗废物和剩余标本都应该被丢弃，但是对于经RT-qPCR检测SARS-CoV-2呈阳性的临床标本，应该在灭菌后丢弃。具有潜在传染性的操作，其稀释或分离等处理程序应在生物安全柜内进行[6]。此外，为了防止检测过程中的污染，为实验室工作人员提供一个安全的环境，应考虑包括实验室布局、检测流程和生物安全设施等问题。

综上所述，COVID-19流行期间实验室分子诊断对于疾病确诊和密切接触者的排查显得尤为重要。各临床实验室应积极制订应对措施以预防和控制COVID-19及其他新发传染病引起的公共卫生事件，进一步提升实验室分子诊断的能力建设与生物安全。