‘黔画乌鸡’IL8RB基因外显子2变异对胸肌常规肌肉品质的影响

向程举，蒋会梅，张依裕，杨远清，吴学树，周艳，杨丹，张贵强，沈杰，刘若余，吴磊

(1.毕节市畜禽遗传资源管理站，贵州 毕节 551700；2.贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，贵州 贵阳 550025；3.贵州大学家禽研究所，贵州 贵阳 550025)

畜禽肌肉品质优劣直接影响产品的市场竞争力，其受到饲料营养、饲养管理、疫病防控、遗传育种等因素的影响[1].畜禽肌肉品质受微效多基因控制，至今已发现许多与肌肉品质相关的基因如FAS、SCD-1、LXRs等[2-3].白介素8受体β亚基(interleukin-8 receptor bata，IL8RB)也被称为C-X-C趋化因子受体2(C-X-C chemokine receptor type 2，CXCR2)，属于视紫红质样 G 蛋白偶联受体超家族成员，通过与IL8结合介导抗炎症细胞聚集、活化和修复损伤的组织，刺激中中性粒细胞、淋巴细胞发生趋化游走等功能[4].IL8RB基因主要在髓样前体细胞和中性粒细胞中表达，IL8RB通过介导活化中性粒细胞，促进其脱颗粒并释放贮存酶，启动超氧离子释放，提升吞噬功能，引起畜禽机体局部炎症反应而实现杀灭病原菌的作用[5].IL8RB也通过与IL-8结合进而参与子宫内膜上皮细胞与胚泡滋养层细胞的相互作用而影响小鼠的繁殖和胚泡着床过程[6-7].奶牛乳腺炎发生过程中，感染的中性粒细胞向乳腺的迁移需要IL8RB的参与，揭示IL8RB在乳腺炎感染过程中的免疫功能发挥重要作用，并能够提高牛奶产量，可作为一个重要的抗牛乳腺炎的候选基因[8-9].最近的研究显示，IL8RB信号通过Wip1、T-bet、微生物群系等调控健康和患病小鼠造血细胞的动员和功能的发挥[10].鸡的IL8RB基因定位于7号染色体上，包含2个外显子，其编码氨基酸的序列位于外显子2，其蛋白为1种糖蛋白，与现已知的趋化因子受体相比较，其蛋白序列的末端跨膜区缺乏保守的(C/S)CXNP基因序列[11].至今，IL8RB信号的生物学功能在人和小鼠上进行了广泛报道，但在家禽上的研究极为匮乏.本研究的试验材料为贵州省近年来发现的优良地方鸡种质资源‘黔画乌鸡’[12]，研究IL8RB基因外显子2的遗传变异，探讨其变异对肉质的影响，为进一步深入研究该基因在家禽中的生物学功能奠定基础，也为开展标记辅助选择提供参考.

1 材料与方法

1.1 试验材料

同批出雏的150只‘黔画乌鸡’母鸡按照同样的饲养管理条件和营养水平于黔西县‘黔画乌鸡’保种选育场进行饲养，自由采食和饮水，全群采用黄芪多糖进行防控，不注射任何疫苗，不使用任何抗生素，120日龄结束饲养，随机抽取94只正常健康的‘黔画乌鸡’进行放血屠宰，收集血样，采集胸肌备用.血液基因组DNA采用苯酚-氯仿法进行提取；胸肌常规肌肉品质按照《猪肌肉品质测定技术规范NY/T821-2004》进行测定，指标包括pH值、失水率、嫩度和蒸煮损失；粗脂肪采用索氏抽提法进行提取，所有肉样测定指标的预处理均在采集后45 min内完成.

1.2 引物设计和PCR扩增

根据GenBank中收录的鸡基因组序列中IL8RB基因序列(NC_006094.5)设计1对特异性引物扩增IL8RB基因外显子2，位于基因组g.22589018-22589557区域，处于基因CDS区c.232-771区域，扩增片段540 bp，正向引物序列5′-CGCTCTGTCACCGATGTCTA-3′，反向引物序列5′-CAGCACCACAGCTAGGATG-3′，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成.PCR扩增体系：RNase-Free Water 10 μL、PCR Master Mix 7.0 μL(购自大连TaKaRa公司)、10 μmol/L正、反向引物各1.0 μL、模板DNA 1.0 μL，终体积20 μL.PCR反应程序：94 ℃预变性8 min；94 ℃ 变性40 s，60 ℃退火50 s，72 ℃延伸40 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存.

1.3 SNPs鉴定和统计分析

2 结果与分析

2.1 IL8RB基因外显子2的SNPs鉴定

用1%的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，结果表明引物特异性良好.对采集的94个样本的PCR产物进行纯化回收测序，进行序列比对，结果显示，在‘黔画乌鸡’IL8RB基因外显子2中共发现4个SNPs位点(图1)：位于基因组序列(NC_006094.5)的g.22589317 C>T突变位于基因CDS区531位，导致177位的密码子CCC变为CCT，均编码脯氨酸(P)；g.22589423 C>T突变位于基因CDS区637位，导致213位的密码子CTG变为TTG，均编码亮氨酸(L)；g.22589476 T>C突变位于基因CDS区690位，导致230位的密码子TAC变为TAT，均编码酪氨酸(Y)；g.22589485 C>T突变位于基因CDS区699位，导致233位的密码子ACC变为ACT，均编码苏氨酸(T)，由此可见，检测到的SNPs位点均未能导致基因编码的氨基酸发生变化，均为同义突变和碱基的转换突变.

2.2 IL8RB基因外显子2的SNP位点的群体遗传信息分析

通过分析IL8RB基因外显子2的SNP位点在‘黔画乌鸡’群体中的遗传信息，结果见表1.结果表明，4个SNP位点均产生3种基因型，均为中度多态SNP位点，基因型分布均未偏离Hardy-Weinberg平衡，g.22589317 C>T、g.22589423 C>T和g.22589485 C>T突变位点产生的等位基因C和基因型CC的频率均为最高，基因型TT的频率处于0.074 5～0.106 4之间，g.22589476 T>C突变位点产生的等位基因T和杂合基因型TC的频率最高，基因型CC的频率仅为0.127 7.

2.3 IL8RB基因外显子2的SNP位点与‘黔画乌鸡’肌肉品质的相关性分析

通过分析IL8RB基因外显子2的SNP位点对‘黔画乌鸡’胸肌常规肌肉品质的遗传效应，结果见表2.结果显示，g.22589317C>T位点对嫩度的影响达到显著水平(P<0.05)，基因型TT个体的嫩度值显著高于基因型CC个体(P<0.05)；g.22589423 C>T和g.22589476 T>C位点均对鲜肉中粗脂肪含量的影响达到显著水平(P<0.05)，g.22589423 C>T位点的基因型TT个体显著高于基因型CT个体(P<0.05)，g.22589476 T>C位点的基因型CC个体显著高于基因型CT和TT个体(P<0.05)，其他各位点各基因型对肌肉品质指标的影响未达到显著水平(P>0.05).

3 讨论

肌肉品质是评价畜禽优异性的重要性状，在畜禽开发利用中具有重要意义，也是决定市场竞争力的关键性状.抗病育种可以通过提高畜禽的抗逆能力，减少疫病发生率和兽药使用，提高畜禽肌肉品质和安全性[13].因此，抗病基因通常作为提高肌肉品质的候选基因来进行研究.趋化因子受体IL8RB在炎症性疾病中广泛表达，其与趋化因子结合能调节单核细胞、中性粒细胞的迁移，并聚集在炎症部位发挥生物学功能[14-15].目前，在人、鼠、奶牛等物种的IL8RB基因中检测到影响炎症反应的遗传变异位点，对开展抗炎症研究提供了良好的借鉴材料[16-17].但是关于家禽IL8RB基因多态性的报道尚缺乏.本研究首次在鸡IL8RB基因外显子2发现4个SNP位点：g.22589317 C>T、g.22589423 C>T、g.22589485 C>T和g.22589476 T>C，由于密码子简并现象，4个SNP位点在突变前后未引起编码氨基酸的改变.据报道，单核苷酸的替换会改变mRNA的剪切效率或准确性，从而影响蛋白质的功能和表达水平的变化，进行调控IL8RB基因表达水平影响畜禽生产性能，因此在本试验中4个SNPs不可忽略[18].每个SNP位点的等位基因频率的差值较大，表现出极有优势的等位基因分布，4个SNP位点各自产生的3种基因分布均处于Hardy-Weinberg平衡状态，揭示4个SNP位点可能未受到基因突变、人工选择和遗传漂变等因素的影响，或者受到影响，但由于育种者根据育种目标进行长期选择和大量扩繁后重新达到新的平衡而改变了原来的平衡状态[19].

图1 SNPs位点鉴定

表1 IL8RB基因外显子2的SNP位点在‘黔画乌鸡’中的遗传信息

表2 IL8RB基因外显子2的SNP位点对‘黔画乌鸡’肉质的遗传效应

同位点同列数据肩标小写字母不同者表示差异显著(P<0.05)，其它则表示差异不显著(P>0.05).

The difference between the shoulder small letters of the same place and the same column was significant(P<0.05)，while the difference between the other two was not significant(P>0.05).

近20余年来，许多研究者开展了畜禽经济性状主效基因的筛选鉴定或相关候选基因的研究工作，表明畜禽结构基因的一些突变位点可显著影响其经济性能，并作为分子标记应用于畜禽育种，取得了明显的选育进展.但关于IL8RB基因遗传变异是否影响家禽经济性能尚缺乏报道.本研究通过关联分析发现，‘黔画乌鸡’IL8RB基因外显子2中g.22589317C>T位点对嫩度的影响达到显著水平，CC基因型个体的嫩度值最低，蒸煮损失和失水率也最低，但粗脂肪含量最高，揭示CC基因型可能有利于改善肉质；g.22589423 C>T和g.22589476 T>C位点均对鲜肉中粗脂肪含量的影响达到显著水平，g.22589423 C>T位点的TT基因型个体胸肌粗脂肪含量最高，失水率、蒸煮损失和嫩度均最低，暗示TT基因型可能对肉质改善有利；g.22589476 T>C位点的CC基因型个体也表现出胸肌粗脂肪含量最高，失水率、蒸煮损失和嫩度均最低，表明CC基因型可能是改善肉质的有利基因型；g.22589476 T>C位点对所检测的5个肉质常规指标的效应未达到显著水平，揭示该位点作为一个标记进行选择肉质时可能取不到明显的育种效果，但是否能与其他位点共同作用加强对肉质的影响需要进一步阐释.分子生物学相关研究表明，畜禽基因组或基因的变异会不同程度的影响DNA构象，引起分子自由能的降低或增加，从而导致基因复制、转录和翻译的速率发生改变，进而影响基因的表达量，基因的生物学功能会受到影响而导致畜禽经济性能的变化[20].但是，本研究由于样本数的限制和基因型分布出明显的偏移现象，没有开展4个SNP位点的连锁不平衡分析，组成的单倍型是否会改变基因mRNA理化性质尚未进行预测或试验验证，4个SNP位点联合双倍型是否会对‘黔画乌鸡’经济性状产生影响或者其效应机制尚有待阐释.因此，课题组下一步研究工作中进一步增加检测的品种和样本数量，紧接本研究的成果继续挖掘IL8RB基因变异位点，深入研究和解释这些变异位点功能发挥的分子机制，加快其应用于畜禽育种工作的可能性.

4 结论

‘黔画乌鸡’IL8RB基因外显子2中发现4个中度多态的同义突变位点：g.22589317 C>T、g.22589423 C>T、g.22589485 C>T和g.22589476 T>C，4个SNP位点均产生3种基因型，g.22589317 C>T位点对嫩度的影响达到显著水平，g.22589423 C>T和g.22589476 T>C位点均对粗脂肪含量的影响达到显著水平，综合各基因型各指标之间的差异，揭示 g.22589317C>T位点的CC基因型、g.22589423 C>T位点的TT基因型和g.22589476 T>C位点的CC基因型是改善肉质的有利基因型，可能作为提高肉鸡肌肉品质的分子遗传标记.