纹党和红芪加工废弃物中的活性多糖对Ⅱ型糖尿病小鼠血糖血脂的影响

叶文斌，宫峥嵘，何玉鹏，陈耀年，赵庆芳，周紫鹃

(1.陇南师范高等专科学校农林技术学院，甘肃 成县 742500；2.西北师范大学生命科学学院，甘肃 兰州 730070；3.中国科学院寒区旱区工程研究所，甘肃 兰州 730000)

中国是世界上农业废弃物产出最大的国家，每年大约有40多亿t[1].随着农业经济的不断发展，农业种植物的固体废弃物也随之增加，预计到2020年将达到2亿t[2].近年来随着国家对中药材种植的政策支持，甘肃省大力实施陇药振兴计划，明确支持建立中药材生产基地，陇南道地中药材纹党(Codonopisispilosula)和黄芪(Hedysarumpolybotrys)是主要的支持和推广种植栽培药材，近3 a陇南纹党和红芪种植面积已达1.3万hm2上，采挖面积0.5万hm2以上，年产量超过600万t，产值达6亿元以上，陇南已成为中国最大的纹党和红芪的生产、加工和销售基地.纹党和黄芪加工时会产生数量巨大的加工废弃物，而对两种中药加工时产生的废弃物处理和资源化的利用研究是当前的面临的重要问题.近年来，随着人民生活水平的不断提高，糖尿病的发生率越来越高，世界卫生组织预测2025年糖尿病患者将达到3亿[3]，糖尿病及其并发症的发生与人体血糖水平密切相关，也与血糖波动有直接关系，血糖波动越大并发症的发生率越高[4].长时间的高糖环境会引起人体及动物体内糖脂代谢的紊乱，降低脏器抗氧化酶活性的表达和增强脂质过氧化水平，从而引起脏器病变导致糖尿病及发生相应的并发症[5].人体血液中糖化血红蛋白含量(HbA1c)能更好地反映机体糖代谢的水平，是血检中评价糖尿病患者的一个重要指标[6].也有学者研究表明 HbA1c 与空腹血糖(FBG)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)的含量之间存在密切关系，在治疗糖尿病及其并发症时，对血脂代谢紊乱的有效调节和血糖水平的及时控制是治疗糖尿病的重点[7-8].目前，虽然市场上治疗糖尿病的药物众多，但主要集中在化学合成药方面，虽然短期治疗效果显著，但长时间的服用和注射会产生不同程度的副作用，如发生过敏反应、脏器病变和心血管疾病等[4-8].

陇南纹党是桔梗科植物党参的根，具有补中益气，健脾益肺之功效，主治脾肺虚弱，气短心悸，食少便溏，虚喘咳嗽，内热消渴等症，陇南市文县出产的纹党或晶党质量最好，是中国国家地理标志产品[9-12]，其主要成分为纹党多糖，占纹党总成分的28.83%[10-11].陇南武都红芪为豆科岩黄芪属植物多序岩黄芪的干燥根[13]，性温，味甘，具有补气固表、利尿解毒、排脓、敛疮生肌等功效[13]，以陇南市武都米仓山特产尤为著名，是中国国家地理标志产品，其主要成分为红芪多糖，占红芪总成分的23%～34%[14].中药多糖类活性物质具有众多的生理功能，党参多糖和红芪多糖同其他药用植物多糖一样，具有广泛的药理作用，而且具有依赖性低、毒副作用小、安全性高、疗效好等特点[15-20].由于纹党和红芪加工时会产生数量巨大加工废弃物，对加工废弃物的处理和资源化利用研究是当前的一个主要问题.为了减少资源的浪费和资源综合利用，本文以腹腔注射链脲霉素(STZ)构建小鼠Ⅱ型糖尿病模型，用两种多糖来对Ⅱ型糖尿病小鼠血糖血脂的影响进行研究，对患病模型动物的治疗功能进行评价，为开发无毒无副作用的降糖替代药物和功能食品提供依据，提高陇南道地中药材纹党和红芪的资源化利用水平和附加值，同时，也为合理利用、节约资源以及综合开发利用提供技术支撑.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

纹党加工废弃物由甘肃省陇南市文县中寨种植基地提供，红芪加工废弃物由甘肃省陇南市武都米仓山种植基地提供；清洁级ICR小鼠，雄性，体质量28～35 g(上海实验动物种子中心)；链脲霉素(Sigma公司)；盐酸二甲双胍片(常州制药厂有限公司生产)；普鲁卡因肾上腺素注射液(上海禾丰制药有限公司生产)；SK5200H超声波清洗仪(广州越特科学仪器有限公司)；RE52AA旋转蒸发仪(北京瑞成伟业仪器设备有限公司)；HH-6数显恒温水浴锅(上海千载科技有限公司)；TGL-16G高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；UV759紫外-可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)；TDL-5000B型低速冷冻大容量离心机(上海安亭科学仪器厂)；LGJ-18型冷冻干燥机(北京四环科学仪器厂)；全自动生化分析仪AU5800(贝克曼库尔特有限公司)；全自动血糖检测仪(爱奥乐医疗器械(深圳)有限公司).

1.2 纹党和红芪加工废弃物活性多糖的提取

参考叶文斌等[10]的方法将纹党和红芪加工废弃物先经过筛选，将筛选的废段、废须和废渣清洗干净后在50 ℃ 烘干，分别通过粉碎仪粉碎后过100目筛，用无水乙醇回流脱脂，50 ℃ 烘干备用，各取100 g，加入500 mL水，在50 ℃温度下热水提取12 h，将提取的上清液经旋转蒸发仪减压浓缩，用 95% 的乙醇沉淀分别获得纹党和红芪粗多糖.将获取的纹党和红芪粗多糖溶于水中，通过 Sevag 试剂去蛋白，通过斐林试剂，去除铜络合物，再分别用乙醇、丙酮、乙醚洗涤，冷冻干燥得洁白的纹党和红芪多糖粉末，后经过DEAE-纤维素柱层析，再过Sephadex G柱纯化后真空冷冻干燥得到纯化的纹党和红芪多糖.

1.3 纹党多糖和红芪多糖对正常小鼠血糖水平的影响

取ICR小鼠 70 只，随机分为 7组.按200 mg/kg剂量每天灌胃1次二甲双胍为药物处理组；按照50、100、200、400和600 mg/kg标准每天灌胃1次纹党多糖和红芪多糖，分别建立纹党多糖和红芪多糖5个剂量组.在试验期间，保证小鼠自由饮食和活动，喂食与二甲双胍等量的生理盐水为对照组，给药后 1 h 眼眶静脉丛采血，用血糖仪测定FBG[8]来筛选最佳纹党多糖和红芪多糖的降糖浓度便于后续试验.

1.4 Ⅱ型糖尿病小鼠模型建立

按照小鼠体质量45 mg/kg标准，用柠檬酸缓冲液溶解STZ配制1%的STZ 溶液.将60只适应性喂养7 d的ICR小鼠，随机平均分成6组，随机取10只小鼠作为CK(0)组饲喂基础鼠饲料；将其余50 只小鼠腹腔一次性注射45 mg/kg新鲜配制的1%的STZ，然后饲喂添加猪油18%、蔗糖20%、蛋黄3%、基础饲料59%的高糖高脂喂养30 d后，在禁食不禁水12 h 后，称质量后眼眶静脉丛采血，用血糖仪测定FBG，将FBG≥11.5 mmol/L 者视为 Ⅱ型糖尿病小鼠造模成功.造模成功后的糖尿病模型组，每天灌胃一次与模型组等体积的生理盐水；按250 mg/kg剂量每天灌胃一次二甲双胍为药物对照组；纹党多糖400 mg/kg剂量组、红芪多糖400 mg/kg剂量组、纹党多糖和红芪多糖400 mg/kg+400 mg/kg复合剂量组，每天灌胃1次.在试验期间，大鼠自由饮食和饮水，连续观察28 d，每隔7 d，测定FBG 和称量体质量，测定FBG前12 h禁食不禁水.

1.5 检测指标

参照叶文斌等[8]的方法按照1.4给药处理后，各组大鼠禁食不禁水12 h，采用血糖仪和血糖试纸，剪尾取血测各组大鼠FBG和糖化血红蛋白；测定FBG后，迅速处死动物并采血，离心收集血清，采用全自动生化分析仪测TC、TG、HDL和LDL水平.

1.6 统计分析

2 结果与分析

2.1 纹党多糖和红芪多糖表征

纹党和红芪加工废弃物经过分离提取、脱色和真空冷冻干燥后得洁白的多糖粉，经过测定纹党多糖和红芪多糖得率分别为16.52%和13.96，将所得纹党多糖配成0.05%的多糖溶液，将红芪多糖配成0.01%的多糖溶液分别在波长为260 nm和280 nm的紫外光谱下扫描，结果均没有蛋白质和核酸的特征吸收峰.参照叶文斌等[8]的方法用HPLC-GPC色谱检测多糖纯度，用面积归一化法进行计算.液相色谱条件：色谱柱Shodex SUGAR SP-G 0810糖分析柱；流动相纯H2O；流速1.0 mL/min；检测器Shodex RI-10A示差折光检测器；柱温80 ℃；进样量20 μL.在 HPLC-GPC 色谱检测中都只出现一个峰，表明得到的纹党多糖和红芪多糖是由一种多糖组成的，面积归一化计算纯度为 99.65%和99.38%.

1：红芪多糖；2：纹党多糖.

2.2 纹党多糖和红芪多糖对正常小鼠血糖水平的影响

二甲双胍具有减少糖异生作用，降低基础肝糖输出，引起基础血糖减低的功效；也可以促进胰岛素与胰岛素受体的结合，增加胰岛素对血糖的清除作用，从而达到人体降血糖的作用.由表1可见，CCP剂量组均能降低正常小鼠血糖，50 mg/kg剂量处理与CK(0)组相比无显著差异(P>0.05)，100～200 mg/kg剂量处理与CK(0)组相比都存在显著差异的降血糖作用(P<0.05)，400～600 mg/kg的CCP剂量处理与CK(0)组比较均有极显著性差异(P<0.01)的降血糖作用，400 mg/kg的CCP剂量组与二甲双胍组相比其降糖效果无显著差异(P>0.05)，且400和600 mg/kg的CCP剂量对正常小鼠降糖作用相差不大.CHP剂量组也均能降低正常小鼠血糖，50～100 mg/kg的CHP剂量处理与CK(0)组相比无显著差异(P>0.05)，200 mg/kg的CHP剂量处理与CK(0)组相比存在显著差异的降血糖作用(P<0.05)，400～600 mg/kg的CHP剂量处理与CK(0)组比较均有极显著性差异(P<0.01)的降血糖作用，CHP400～600 mg/kg剂量组与二甲双胍组相比其降糖效果均无显著差异(P>0.05).这也表明，纹党多糖和黄芪多糖剂量在400 mg/kg时对正常小鼠血糖水平的降低效果与二甲双胍基本相同，虽然降糖效果没有二甲双胍明显，但比较温和，所以将两种中药多糖的剂量筛选为400 mg/kg来进行后续研究.

2.3 纹党多糖和红芪多糖对Ⅱ型糖尿病小鼠血糖的影响

由表2可见，各处理组小鼠的血糖均表现出明显的升高，且与CK(0)组小鼠之间均存在极显著差异(P<0.01).连续灌胃给药7 d后，二甲双胍组小鼠血糖在不同时期均表现为明显的降低，与STZ模型组相比存在均有极显著差异(P<0.01).CCP组小鼠灌胃给药28 d后的血糖值与STZ模型组相比有极显著性差异(P<0.01)，与二甲双胍组比较血糖高于二甲双胍组(P<0.05)，CHP组小鼠灌胃给药28 d后的血糖值与STZ模型组相比也存在极显著性差异(P<0.01)，与二甲双胍组相比血糖明显高于二甲双胍组(P<0.01)，CCP和CHP联合组小鼠灌胃给药28 d后的血糖值与STZ模型组相比存在极显著性差异(P<0.01)，与二甲双胍组的血糖相比没有显著性(P>0.05).以上结果表明，CCP对Ⅱ型糖尿病小鼠血糖具有较好的降血糖作用，且降血糖效果优于CHP，而CCP和CHP联合用药对Ⅱ型糖尿病小鼠降血糖效果最好，与二甲双胍组无显著差异(P>0.05).

表1 纹党多糖和黄芪多糖对正常小鼠血糖水平的影响

与CK(0)组比较，*P<0.05，**P<0.01；与二甲双胍组比较，#P<0.05，##P<0.01.

Compared with CK(0)group,*P<0.05,**P<0.01；Compared with metformin group,#P<0.05,##P<0.01.

表2 纹党多糖和红芪多糖对Ⅱ型糖尿病小鼠空腹血糖的影响

与CK(0)组比较，**P<0.01；与STZ模型组比较，#P<0.01，##P<0.01；与二甲双胍组比较，☆P<0.01，☆☆P<0.01.

Compared with CK(0)group,**P<0.01；Compared with STZ-group,#P<0.05；##P<0.01;Compared with metformin group,☆P<0.01,☆☆P<0.01.

2.4 纹党多糖和红芪多糖对Ⅱ型糖尿病小鼠体质量的影响

由表3可知，在STZ 诱导Ⅱ型糖尿病小鼠模型组成功后7 d 内出现饮水、进食及尿量明显增加，体质量略有下降，活动减少等表现，CK(0)组小鼠随时间的推移体质量增加明显，与STZ模型组存在极显著差异(P<0.01)，在连续给药28 d后，CCP、CHP、CCP和CHP联合治疗3个组小鼠体质量都逐渐呈现出不同的增加趋势.CCP组小鼠灌胃给药治疗28 d后的体质量增加明显，与二甲双胍组相比有显著性差异(P<0.05)，CHP组小鼠灌胃给药治疗28 d后的体质量有所升高，但与二甲双胍组相比还存在极显著性差异(P<0.01)，CCP和CHP联合给药后Ⅱ型糖尿病小鼠的体质量增加迅速，与CK(0)组小鼠之间不存在显著差异(P>0.05)，治疗效果与二甲双胍组相比也没有显著性(P>0.05)，而且小鼠活动与精神状况良好.

2.5 纹党多糖和红芪多糖对Ⅱ型糖尿病小鼠糖化血红蛋白的影响

由表4可知，CCP、CHP、CCP和CHP联合组在连续给药治疗28 d后，小鼠糖化血红蛋白含量均呈下降趋势，CCP与STZ模型组相比糖化血红蛋白含量极显著降低(P<0.01)，效果没有二甲双胍组明显，但对小鼠糖化血红蛋白含量降低的作用却明显高于CHP组，而CCP和CHP联合给药治疗28 d后糖尿病小鼠的糖化血红蛋白含量与模型组比较，降低效果明显，具有极显著差异(P<0.01)，与二甲双胍组的糖化血红蛋白含量无显著差异(P>0.05).这也说明CCP、CHP能够有效降低Ⅱ型糖尿病小鼠糖化血红蛋白的含量，其中CCP和CHP的联用效果最佳.

表3 纹党多糖和红芪多糖对Ⅱ型糖尿病小鼠体质量的影响

与CK(0)组比较，**P<0.01；与STZ模型组比较，#P<0.05，##P<0.01；与二甲双胍组比较，☆P<0.01，☆☆P<0.01.

Compared with CK(0)group,**P<0.01；Compared with STZ-group,#P<0.05,##P<0.01；Compared with metformin group,☆P<0.01，☆☆P<0.01.

表4 纹党多糖和红芪多糖对Ⅱ型糖尿病小鼠糖化血红蛋白含量的影响

与CK(0)组比较，**P<0.01；与STZ模型组比较，#P<0.01，##P<0.01；与二甲双胍组比较，☆P<0.01，☆☆P<0.01.

Compared with CK(0)group,**P<0.01；Compared with STZ-group#P<0.05,##P<0.01；Compared with metformin group,☆P<0.01，☆☆P<0.01.

2.6 纹党多糖和红芪多糖对Ⅱ型糖尿病小鼠血脂代谢的影响

由表5可知，CCP、CHP、CCP和CHP联合组在连续给药治疗28 d后与CK(0)组相比，STZ糖尿病模型小鼠TC、TG和LDL均表现出极显著的升高趋势(P<0.01)，而HDL极显著降低(P<0.01).二甲双胍组治疗28 d后与STZ模型组比较，TC、TG 和LDL均有极显著升高(P<0.01)，HDL极显著降低(P<0.01).连续给药CCP治疗28 d后与CK(0)组比较小鼠的TC、TG 和LDL显著降低(P<0.05)，HDL显著升高(P<0.05)，CHP治疗后小鼠的TC、TG、LDL和HDL与CK(0)组相比治疗效果不如CCP；而CCP和CHP联合给药治疗28 d后糖尿病小鼠的TC、TG和LDL含量与模型组比较，降低效果明显，具有极显著性差异(P<0.01)，HDL升高也存在极显著差异(P<0.01)，其对糖尿病模型小鼠血脂的调节作用与二甲双胍组相当，两组的TC、TG、HDL及LDL 含量均无显著性差异(P>0.05).结果表明CCP、CHP能够有效调节Ⅱ型糖尿病小鼠的血脂.

表5 纹党多糖和红芪多糖对Ⅱ型糖尿病小鼠血脂代谢的影响

与CK(0)组比较，**P<0.01；与STZ模型组比较，#P<0.01，##P<0.01；与二甲双胍组比较，☆P<0.01，☆☆P<0.01.

Compared with CK(0)group,**P<0.01；Compared with STZ-group#P<0.05,##P<0.01;Compared with metformin group,☆P<0.01，☆☆P<0.01.

3 讨论与结论

糖尿病患者对葡萄糖利用较低，会引起脂肪动员，从而导致血脂含量升高等并发症[20]，引起脂类代谢紊乱的主要原因是胰岛素分泌不足，调节血糖的功能不强，使血液中 TG、TC水平升高，诱发脂蛋白的糖基化，增强机体脂质过氧化，HbAlc含量上升.HDL是血液中密度最高、颗粒最小的一种脂蛋白，是血脂代谢的基础物质，专门在体内结合多余血脂，转运体外，清除血液垃圾，且由于体积小，能穿透动脉内膜将沉积在里面的胆固醇清除掉并携带出血管壁，修复血管内皮破损细胞，恢复血管弹性，具有清除血管内多余血脂，清除血垢，清洁血管的作用.医学临床上认为，HDL是将肝外组织的胆固醇运送到肝脏的工具，因而可以防止游离胆固醇在肝外组织细胞上的沉积，所以HDL是对糖尿病患者的并发症如冠心病临床诊断是一个重要的参考指标，它的升高是临床冠心病保护因子之一，并能防治和延缓动脉粥样硬化的发展.相反的如果血液中LDL浓度升高，将沉积于心脑等部位血管的动脉壁内，逐渐形成动脉粥样硬化性斑块，阻塞相应的血管，加重糖尿病并发症的发生率.

用陇南道地中药材纹党和红芪加工废弃物中提取的活性多糖对Ⅱ型糖尿病小鼠血糖血脂的影响的研究结果显示，经过28 d的灌胃治疗，纹党多糖和红芪多糖均能降低正常小鼠的FBG，纹党多糖降糖能力优于红芪多糖，纹党多糖和红芪多糖组合降糖能力最好，能有效降低Ⅱ型糖尿病小鼠的FBG、HbAlc、TC、TG和LDL含量，促进HDL水平的升高，并能显著改善Ⅱ型糖尿病小鼠血脂代谢紊乱.STZ造模成功后的各组小鼠体形则明显消瘦，体质量逐渐变轻，经过纹党多糖和红芪多糖28 d的灌胃治疗后，Ⅱ型糖尿病小鼠体质量随时间推移，均表现出不同程度的增加，尤其纹党多糖和红芪多糖联合给药后Ⅱ型糖尿病小鼠的体质量增加迅速，与CK(0)组小鼠之间不存在显著差异，治疗效果与二甲双胍组等同，而且小鼠活动与精神状况良好.

综上所述，纹党多糖和红芪多糖联用具有很好的促进Ⅱ型糖尿病小鼠体质量恢复的作用.虽然两种多糖的的降血糖作用没有二甲双胍强烈，但降糖作用比较缓慢和温和，不易出现降糖药品强烈的低血糖反应，是一种比较好的降糖物质.本研究为开发无毒无副作用的降糖替代药物和功能食品提供了科学依据.