褪黑素对盐碱复合胁迫下垂丝海棠光合及生理特性的影响

高立杨 刘兵 张瑞 张夏燚 王延秀

(甘肃农业大学园艺学院，甘肃 兰州 730070)

我国是世界上最大的苹果生产国[1]，西北黄土高原产区是我国四大苹果主产区之一，具有海拔高、光照充足、昼夜温差大等优势，但该区多为石灰质土壤，70%以上的土壤为含NaCl与NaHCO3的盐碱土壤，严重制约苹果产业的发展[2].因此研究耐盐碱砧木对于盐碱地区的苹果种植具有重要意义.

褪黑素(melatonin,MT)是广泛存在于动植物体内一类重要的吲哚类化合物[3].有研究表明，虽然褪黑素在植物体内含量极低，却可以大大提高植物的耐性，缓解干旱、低温、盐碱等胁迫环境对植物造成的伤害[4].LI等[5]在湖北海棠上的研究发现，褪黑素可以有效缓解盐胁迫下叶片叶绿素的降解，提高光合速率；王平等[6]证实褪黑素可以有效延缓植物叶片衰老，提高光合能力；此外，杨新元[7]在向日葵上的研究表明，外源褪黑素可显著提升干旱胁迫下向日葵幼苗叶片的Pn、Gs、Tr,提高抗氧化酶活性和叶绿素含量.

有关盐碱胁迫对植物生理特性的影响已有众多报道[8-12]，土壤盐渍化会对植物造成渗透胁迫、离子毒害、氧化胁迫以及改变液泡和细胞pH等危害，当胁迫浓度超过植株最大耐受力，植物就会发生萎蔫，甚至枯死.张瑞等[9]研究发现，在盐碱复合胁迫下，‘长富二号’和‘烟富六号’苹果的净光合速率、气孔导度、蒸腾速率等光合参数随胁迫时间的延长均出现下降趋势；孙璐等[10]指出，盐碱胁迫破坏了PSⅡ中心，抑制了光合电子传递，造成了植物叶绿素合成受阻及光合速率下降.郭淑华等[11]在葡萄上证实了盐碱胁迫下光合色素含量呈降低趋势；金微微等[12]则报道了在盐碱胁迫下，由于渗透胁迫，使细胞膜系统受损，电解质外渗造成相对电导率升高，叶片失水等;范海霞等[13]研究发现，盐碱胁迫下，造成活性氧的积累，植物依靠抗氧化系统的启动，大量积累SOD、POD等抗氧化酶来清除活性氧，以缓解氧化胁迫.前人研究中对单盐单碱的协迫研究较多，而对盐碱复合胁迫对植物生理特性的影响鲜有研究.因此，探索外源物质对植物在盐碱复合胁迫下所受伤害的缓解作用，对生产中使用化学调控的手段来提高作物耐受性具有重要意义.

垂丝海棠(MalushallianaKoehne)原产于甘肃河西走廊，性喜阳光，可在微酸微碱条件下生长，是西北地区特色砧木[14].垂丝海棠作为一种珍贵的砧木资源，仅在国内有几篇在生产应用方面的研究报道.故本研究选用7～8叶龄的垂丝海棠实生苗为试验材料，探讨垂丝海棠幼苗外源喷施不同浓度褪黑素后，在盐碱胁迫下生理生化指标的变化，旨在筛选出缓解盐碱胁迫对垂丝海棠伤害的最适褪黑素浓度，为西北产区利用化学手段调控作物耐受性提供依据.

1 材料与方法

1.1 试验材料及设计

试验于2018年3月～2018年9月在甘肃农业大学避雨棚中进行.2018年3月对垂丝海棠种子进行消毒并层积处理，4月在穴盘播种，5月份移栽至盛装0.6 kg基质(20%蛭石、20%珍珠岩、60%泥炭)，直径12 cm，深30 cm的花盆内，每盆1株，进行统一管理，待幼苗生长至7～8叶龄时开始处理.喷施50(T1)、100(T2)、200(T3)、300(T4)、400 μmol/L(T5)的褪黑素溶液，每株喷施20 mL，每2 d喷施1次，共喷施3次.于最后一次喷施后的第2天每株一次性浇灌500 mL加盐Hogland营养液(100 mmol/L，50 mmol/L NaCl与 50 mmol/L NaHCO3按摩尔比1∶1混合)，对照CK1(未喷施褪黑素+Hogland营养液)，CK2(未喷施褪黑素 +Hogland营养液+100 mmol/L盐)浇灌体积相同；每个处理15株，3次重复，每重复5株，之后每3天浇灌1次Hogland营养液，并在花盆底部放置托盘，第2次浇灌时用营养液冲洗托盘浇入花盆，防止盐的流失，保证胁迫一致.

1.2 测定指标与方法

1.2.1 光合指标及叶绿素含量的测定 分别于胁迫0、3、6、9 d后，采用LI-6400(LI-COR，Linco ln，NE，USA)便携式光合仪于晴天早上9∶00～11∶00，选取接穗向阳、成熟的叶片测定净光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)、胞间CO2浓度(Ci)、气孔导度(Gs)，重复6次.光合仪系统控制叶片温度25 ℃，测定系统采用开放式气路，自然光源，光合有效辐射为400～600 μmol/(m2·s)，叶室内空气流量设定为500 mL/min，室内CO2体积分数为(385±10)μL/L.

与气体交换参数测定同步进行，采用叶绿素计(Minolta SPAD-502Chloropyhll Meter,Japan)测定相对叶绿素含量.

1.2.2 相对电导率的测定 测定时间同1.2.1，相对电导率采用电导法[9]，用电导率仪(DDS-307)测定.

1.2.3 叶片相对含水量的测定 测定时间同1.2.1，从植株上用剪刀分离叶片，称取鲜质量后装入纸袋，105 ℃杀青1 h，在80 ℃下烘干至恒质量后称取干质量，叶片相对含水量计算公式：

1.2.4 SOD、POD酶活性测定 测定时间同1.2.1，超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性采用李合生[16]的方法测定.

1.3 数据分析

用Microsoft Office Excel 2013及Origin 2017进行数据处理及作图，采用SPSS 22.0单因素ANOVA的LSD进行差异显著性分析.

2 结果与分析

2.1 盐碱复合胁迫下褪黑素对垂丝海棠相对电导率的影响

由图1可得，随着胁迫时间的延长，T1～T5和CK2叶片相对电导率均呈逐渐升高趋势，而CK1基本无变化.胁迫至第3天时，CK1的相对电导率显著低于CK2，T1、T2、T4、T5显著高于CK1，且显著低于CK2(P<0.05)，T3显著低于CK2且与CK1无显著差异(P<0.05).胁迫至第9天时，CK1的相对电导率显著低于CK2，T1、T2、T3、T4、T5的相对电导率均显著高于CK1，且显著低于CK2(P<0.05)，比CK1分别升高了47.19%、35.64%、26.24%、40.17%和45.18%.由此可见T3膜受损害的程度最小.

图1 盐碱胁迫下不同浓度褪黑素处理对垂丝海棠相对电导率的影响

2.2 盐碱复合胁迫下褪黑素对垂丝海棠叶片相对含水量的影响

由图2可得，随着胁迫时间的延长，T1～T5和CK2的叶片相对含水量呈逐渐降低趋势，CK1无显著变化，胁迫至第3天时，T1～T5的叶片相对含水量均显著低于CK1，而显著高于CK2(P<0.05).胁迫至第9天时，T1～T5的叶片相对含水量均显著低于CK1，且显著高于CK2，较CK2分别提高了45.48%、64.24%、80.91%、66.16%和55.41%.由此可见T3的耐性最强.

2.3 盐碱复合胁迫下褪黑素对垂丝海棠相对叶绿素含量的影响

由图3可得，随着胁迫时间延长，所有处理组的相对叶绿素含量均呈降低趋势.胁迫至第3天时，T1、T2、T4、T5相对叶绿素含量显著低于T3和CK1，而显著高于CK2(P<0.05)，T3与CK1无显著差异，但显著高于CK2(P<0.05).胁迫至第9天时，所有处理的相对叶绿素含量均显著低于CK1，而显著高于CK2(P<0.05)，分别比CK2高131.10%、99.90%、166.69%、123.22%和105.93%.

2.4 盐碱复合胁迫下褪黑素对垂丝海棠气体交换参数的影响

由图4可得，胁迫至第9天时，T1～T5的Pn、Gs、Tr均显著低于CK1，而显著高于CK2(P<0.05)；Ci显著高于CK1，而显著低于CK2(P<0.05).Pn分别比CK2提高32.20%、55.41%、71.30%、52.25%、24.54%；Gs分别比CK2提高40.38%、65.25%、110.17%、65.57%、41.25%；Tr分别比CK2提高14.10%、27.27%、50.79%、45.27%、29.31%；Ci比CK2分别降低15.25%、22.88%、31.36%、22.03%、13.98%.

图3 盐碱胁迫下不同浓度褪黑素处理对垂丝海棠相对叶绿素含量的影响

图4 盐碱胁迫下不同浓度褪黑素处理对垂丝海棠气体交换参数的影响

2.5 盐碱复合胁迫下褪黑素对垂丝海棠抗氧化酶活性的影响

由图5可得，随着胁迫时间的延长，所有处理组的SOD活性均呈先升后降的趋势，胁迫至第3天，所有处理SOD活性均高于处理前，其中T1和T5达到峰值，分别为106.89 U/g和104.99 U/g；胁迫至第6天时，T2、T3、T4的SOD活性达到峰值，分别为120.31、130.89、119.61 U/g；胁迫至第9天时，所有处理的SOD活性均显著高于CK2(P<0.05)，较CK2分别提高9.75%、34.35%、53.02%、33.50%和8.47%，且CK1与CK2无显著差异(P<0.05).

由图6可得，随着胁迫时间的延长，所有处理组的POD活性均呈先升后降的趋势，胁迫至第3天时，所有处理POD活性均出现上升，其中T1和T5达到峰值，分别为180.96、180.21 μmol/(g·min)；胁迫至第6天时，T2、T3、T4的SOD活性达到峰值，分别为190.32、213.85、192.21 μmol/(g·min)；胁迫至第9天时，所有处理和CK1的SOD活性均显著高于CK2(P<0.05)，较CK2分别提高19.99%、65.55%、90.51%、67.29%、18.24%和21.97%，且CK1与CK2无显著差异(P<0.05).

图5 盐碱胁迫下不同浓度褪黑素处理对垂丝海棠SOD活性的影响

图6 盐碱胁迫下不同浓度褪黑素处理对垂丝海棠SOD活性的影响

3 讨论

3.1 盐碱复合胁迫下褪黑素对垂丝海棠相对电导率的影响

细胞膜是细胞维持稳定胞内代谢环境的必要屏障[17]，其选择透过性可以调节物质的进出.大量研究表明，植物在盐碱复合胁迫下，由于离子毒害、pH和渗透胁迫作用，会造成细胞膜受损，进而造成离子外渗[18].相对电导率可以反映植物在逆境条件下透性变化和膜受损程度，相对电导率越高，说明植物受伤害程度越高[19].本试验中，随着胁迫时间延长，所有处理的相对电导率均呈上升趋势，说明盐碱复合胁迫下垂丝海棠的膜系统被破坏造成了电解质外渗，这与王硕[20]在紫花苜蓿上的研究结果相一致.此外，Dinneny等[21]研究表明，盐碱胁迫下，植物离子吸收平衡被破坏，Na+大量积累，对细胞产生了专性毒害作用，进而使电导率升高.胁迫9 d时，所有处理的相对电导率相比于CK1均有所上升，T3上升幅度最小，说明T3的膜受损伤程度最低，即200 μmo/L的褪黑素对垂丝海棠在盐碱复合胁迫下所受伤害缓解作用最好.刘旭等[22]在烟草上也证实了盐碱胁迫下褪黑素可以有效缓解烟草所受伤害.此外，Murch等[3]研究发现，植株叶片中离子通道 Na+和 K+转运蛋白基因(NHX1和 AKT1)显著上调，液泡膜中的NHX能够将过量的Na+区隔于液泡中，降低胞质中 Na+含量，减轻过量 Na+对细胞质中代谢酶的毒害，维持离子稳态，进而提高植株耐盐性.因此，本试验中，褪黑素缓解垂丝海棠叶片细胞膜伤害可能与Na+和 K+转运蛋白基因(NHX1和AKT1)的上调有关.

3.2 盐碱复合胁迫下褪黑素对垂丝海棠光合、叶片相对含水量的影响

光合作用可作为判断植物长势和抗逆性强弱的重要指标.大量的研究表明，盐碱胁迫下影响光合作用的因素包括气孔和非气孔因素,当Ci和Gs同时降低时，光合速率降低是由气孔因素引起，反之，则为非气孔因素[23-24]，这与本文研究结果相一致.在盐碱复合胁迫下，胁迫至第9天时，所有处理和CK2的Pn、Gs、Ci、Tr均显著高于CK1，说明本试验中引起垂丝海棠光合能力下降的主导因素为非气孔因素.这可能是盐碱复合胁迫诱导的渗透胁迫、离子毒害和高pH损害PSⅡ氧化侧的放氧复合物的功能，使它向PSⅡ反应中心提供的电子数量减少，进而导致植株光合能力下降[25].本试验所有处理中，T2的Pn和Gs最高，Ci最低，说明较高的Gs为T2叶片提供了充足的水分，使其保持了较高的Pn和同化率这与本试验中叶片相对含水量的研究结果相吻合，也与范慧玲等[26]在芸芥上的研究结果相一致.闫萌萌等[27]研究表明，不同光质对花生幼苗叶片叶绿素含量的影响不同，叶绿素含量增加,则光合效率高.本试验中，相对叶绿素含量的变化趋势与Pn相同.于爽等[28]在龙葵幼苗上也得出相同结论，即盐碱复合胁迫下，叶绿素含量呈降低趋势，进而使光合速率下降.以上说明非气孔因素对植物光合的影响是多方面的.此外李猛等[22]在烟草应对盐胁迫的研究中，植株的Ci呈降低趋势，而本试验中Ci则呈上升趋势，可能是作物特性不同和气孔因素造成的.

3.3 盐碱复合胁迫下褪黑素对垂丝海棠抗氧化酶活性的影响

盐碱复合胁迫下，由于植物光合作用被抑制，过剩的光能会对植物的膜系统造成破坏，产生大量的活性氧、自由基，形成氧化胁迫，对植物造成严重伤害[29].SOD、POD能够清除生物体内超氧阴离子自由基，延缓植株衰老，保护机体免受自由基的伤害[30].本试验中，所有处理的SOD、POD活性均呈先升后降趋势，T1、T5、CK2的两种抗氧化酶活性在第3天时达到峰值，T2、T3、T4则是在第6天时达到峰值，达到峰值说明已经达到了植株最大耐受性，突破此临界值时后又开始下降.与王鑫[31]在羊草上的研究结果相一致，在盐碱胁迫下，羊草的SOD、POD活性呈先升后降的趋势.这是由于植物通过抗氧化酶系统的启动来清除活性氧，缓解植物在胁迫下所受的渗透伤害，当胁迫超过植株最大耐受力后，抗氧化酶系统完全被破坏，SOD、POD活性出现下降[32].王平等[6]在平邑甜茶上的研究发现，外源褪黑素可延缓叶片衰老，且抑制与植物衰老有关的基因(SAG12)的转录水平，这一结果被认为是外源褪黑素增强了植株抗氧化能力.本试验中，T3的两种酶活性峰值出现的时间晚于T1和T5，且T3峰值高于所有处理，说明T3的抗氧化能力最强.

4 结论

综上所述，盐碱复合胁迫下适宜浓度的褪黑素通过提高垂丝海棠相对叶绿素含量、叶片相对含水量、光合能力，增强抗氧化酶活性，改善渗透调节来缓解盐碱复合胁迫对植物的伤害.且褪黑素具有浓度效应，200 μmol/L为最佳浓度.