黄芪多糖对犬盲肠菌群的影响

舒迎霜，贺濛初，桂雪儿，夏晓冬，冯士彬，李玉，王希春，吴金节

(安徽农业大学动物科技学院，安徽 合肥 230061)

黄芪在我国已有两千多年的使用历史，味甘微温，具有益气固表、敛汗固脱、利水消肿之功效[1].其中黄芪多糖是黄芪中最主要的活性成分，是一种可溶于水的中杂性多糖，在体内体外均具有显著的免疫调节作用，可参与机体的一系列免疫反应、抗肿瘤和抗氧化等过程[2-3].经研究证实，肠道内微生物、多糖的代谢与机体免疫水平三者相互作用、密不可分[4].多糖可显著促进肠道内益生菌的增殖，提高肠道微生物多样性，肠道微生物亦可参与多糖代谢，将多糖降解为短链脂肪酸，短链脂肪酸含量与肠道免疫与健康密切相关[5-7].犬肠道中微生物较为丰富的部位为后肠段，其中盲肠内微生物多样性最高，试验表明通过调控犬肠道内微生物的多样性可改善犬肠道免疫功能，影响机体健康[8].Tanl等[9]研究认为，黄芪多糖可显著提高畜禽生产性能并且能够改善畜禽肠道发育.何旭云等[10]发现黄芪多糖可恢复高脂饮食诱导肥胖小鼠的肠道菌群紊乱现象.廖宁波等[11]发现河蚬多糖 CSPF-N可改变肠道微生物结构，微生物结构主要由厚壁菌门、变形菌门、放线菌门和拟杆菌门组成.

前期研究表明，黄芪多糖可增强犬血清及肠粘膜免疫，加强其机体免疫力[12].本研究拟以18只健康比格犬为试验动物，在日粮中添加黄芪多糖，通过高通量测序技术对犬盲肠菌群细菌数量、菌群多样性以及群落结构组成和丰度进行分析，探讨黄芪多糖对犬盲肠菌群的影响，进一步探讨其作用机理，为黄芪多糖在生产实践中的应用提供依据.

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验选取18只1岁龄健康比格犬，由安徽农业大学动物医院提供，动物合格证号为ZXD-C2017917，体质量约10 kg，试验前正常饲养观察7 d，试验前常规驱虫与免疫，每天定时饲喂2次基础日粮，上下午各1次(每次15 g/kg)，自由饮水.

黄芪(制备好的中药饮片)，购自合肥立方大药房；PBS缓冲液，购自北京索莱宝科技有限公司；三氯乙酸、NaOH，购自国药集团化学试剂有限公司；食用酒精，购自无锡展望化工试剂有限公司.

TD-100小型提取浓缩机，购自浙江森力机械科技有限公司；LGJ-12N冷冻干燥机，购自北京亚星仪科科技发展有限公司；DHG-9243B5-Ⅲ电热恒温干燥箱，购自上海新苗医疗器械有限公司；HHS型数显式电热恒温水浴锅，购自上海博讯实业有限公司；台式低速离心机，购自湖南赫西仪器装备有限公司.

1.2 试验方法

1.2.1 中药制备 根据文献[13]报道，称取5 kg黄芪，去除杂质，清洗3次，沥干水分，按照料液比1∶10的比例加入50 L浓度为80%的酒精提取3次，每次1 h，去除油脂.取出未粉碎的药渣用电恒温干燥箱60 ℃烘干，再称质量，按照料液比1∶20的比例加入纯水，超声波震荡提取80 min.将药液转移至浓缩罐中浓缩至4 L，再加入3倍量的95%的酒精，4 ℃静置12 h，使黄芪多糖沉淀，3 000 r/min离心5 min，取沉淀，加蒸馏水溶解至4 L.加入等体积5%的三氯乙酸，同时加入适量活性炭(样品量的15%～20%)脱色，滤去活性炭，4 ℃静置24 h，使蛋白沉淀除去蛋白.3 000 r/min离心5 min，弃去沉淀，取上清液加2 mol/L的NaOH调节pH为7.0，浓缩至4 L.加入3倍量95%酒精，使醇浓度达到80%，低温静置，得疏松沉淀物，洗涤干燥得脱蛋白黄芪多糖粉，4 ℃保存备用.考马斯亮蓝法测得蛋白质去除率为80.25%，苯酚硫酸法测得多糖含量为12.91%.

1.2.2 试验动物分组 将18只犬随机分为3组，即对照组(只饲喂基础日粮)，低剂量组(基础日粮+以生药计1%的黄芪多糖)，高剂量组(基础日粮+以生药计2%的黄芪多糖)，每组6只，试验期14 d，试验期间各组犬的管理条件完全一致.

1.2.3 样品采集 第14天，将全部试验犬麻醉放血后再解剖.点酒精灯在超净工作台内采取盲肠内容物于2 mL无菌管中，保存于-80 ℃冰箱，用于高通量测序.

1.2.4 总DNA提取和16S rDNA测序 使用QIAamp DNA Microbiome Kit试剂盒提取犬盲肠内容物中细菌总DNA，具体步骤参照试剂盒说明书进行.通过分光光度计检测在260 nm处的OD值测得DNA的浓度，置于-20 ℃冰箱保存备用.

根据16S rDNA 基因的V4区保守序列设计通用引物对：515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTC TAAT-3′)进行PCR扩增.PCR反应体系：Q5 Reaction Buffer 0.5 μL，灭菌超纯水8.75 μL，Q5 GC high Enhancer 5.0 μL，dNTP 2.0 μL，上下游引物各1.0 μL，Q5 Polymerase 0.25 μL，模板DNA(40 ng)2.0 μL.扩增条件为94 ℃预变性300 s，随后94 ℃ 60 s，64 ℃复性60 s，72 ℃延伸600 s，共25个循环.每个样本3个重复，PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测.文库测序使用Agilent 2100生物分析仪(Agilent DNA 1000 Reagents)确定平均分子长度，并通过实时定量PCR(q-PCR)(TaqMan Probe)对文库进行定量.总DNA 提取、PCR 扩增和基于Illumina MiSeq平台的测序由深圳华大基因协助完成.

1.3 数据处理

样品数据经过数据过滤，滤除低质量的reads，剩余高质量的Clean data方可用于后期分析；通过reads之间的Overlap关系将reads拼接成Tags；在给定的相似度下将Tags聚成OTU，然后通过OTU与数据库比对，对OTU进行物种注释；基于OTU和物种注释结果进行样品物种复杂程度分析以及组间物种差异分析.

2 结果与分析

2.1 测序结果与α多样性分析

2.1.1 测序结果 从对照组、黄芪多糖低剂量组和黄芪多糖高剂量组3组犬盲肠9个样品中共获得885 399条Tags,通过在97%的相似度下将已拼接优化的Tags聚类为OTU，OTU主要用于将不同物种进行分类，可以通过OTU所代表的不同种属找出不同环境下的核心生物.每个样品OTU统计结果如表1所示.

表1 测序结果

Venn图展示了所有样品的OTU数，并且可以直观的看出样品之间独有和重叠的OTU数目.OTU的丰度表示样品的丰度.由图1可知，本试验的9个样品总共得到OTU数为1 710个，对照组559个，黄芪多糖低剂量组573个，黄芪多糖高剂量组578个.结果显示，黄芪多糖组与对照组之间菌群丰富程度存在差异，黄芪多糖组菌群丰富度较对照组有升高趋势，而黄芪多糖低剂量组与高剂量组之间菌群丰度无明显差异.

2.1.2 Alpha多样性分析 Alpha多样性分析是针对某个样品内物种的多样性进行分析，主要包括Observed species指数、Chao指数、Ace指数，Shannon指数以及Simpson指数等.前4个指数越大，最后1个指数越小，说明样品中的物种丰富度越大，群落多样性越高.由表2可知，对照组前4个指数均小于黄芪多糖组，Simpson指数大于黄芪多糖组，说明黄芪多糖组盲肠内容物的丰富度和多样性高于对照组，且各个样品的覆盖率均大于0.999，测序的深度几乎覆盖了样本中的所有物种，表明本试验数据具有有效性.

D:对照组；E:黄芪多糖低剂量组；F:黄芪多糖高剂量组.

2.2 PCA分析

PCA分析即主成分分析，不同样品的OTU组成不同，通过分析样品的OTU组成，可以反映样品微生物组成的差异.如果在二维平面上2个样品距离越相近，则组成就越相似.本试验的主成分分析图如图2所示，图中横坐标为第一主成分分析(PC1)，检测到的总微生物的代表性贡献率为48.44%，纵坐标为第二主成分分析(PC2)，贡献率为22.13%.对照组点与黄芪多糖组点明显分开，离散性较高，表明对照组与黄芪多糖组样品中微生物组成差异较大；黄芪多糖低剂量组和高剂量组点基本聚集在同一范围内，离散性低，重叠部分较大，虽也分开但距离相近，说明饲喂黄芪多糖组犬盲肠内微生物组成更为相似.

横坐标表示第一主成分，括号中的百分比则表示第一主成分对样品差异的贡献值；纵坐标表示第二主成分，括号中的百分比表示第二主成分对样品差异的贡献值；图中点分别表示各个样品；不同颜色代表样品属于不同的分组.

表 2 Alpha多样性分析

2.3 犬肠道微生物组成及其丰度分析

2.3.1 门水平上肠道微生物丰度 由表3和图3可知，在门水平上犬肠道微生物主要由5个优势菌门组成，分别为放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、梭杆菌门(Fusobacteria)、变形菌门(Proteobacteria).

与对照组相比，黄芪多糖组放线菌门和厚壁菌门显著升高(P<0.05)；变形菌门显著降低(P<0.05).黄芪多糖组拟杆菌门和梭杆菌门差异均不显著(P>0.05)，但梭杆菌门有降低趋势.

图3 样本门分类水平中物种分布柱状图

表3 肠道微生物在门水平的物种丰度显著性分析

不同小写字母表示差异显著(P<0.05).

The lowercase letters indicate significant difference(P<0.05).

2.3.2 纲水平上肠道微生物丰度 由表4可知，在纲水平上犬肠道微生物主要由8个优势菌群组成，分别由放线菌纲(Actinobacteria)、芽孢杆菌纲(Bacilli)、拟杆菌纲(Bacteroidia)、β-变形菌纲(Betaproteobacteria)、梭菌纲(Clostridia)、丹毒丝菌纲(Erysipelotrichia)和梭杆菌纲(Fusobacteriia)组成.

与对照组相比，黄芪多糖组放线菌纲和芽孢杆菌纲显著升高(P<0.05)，β-变形菌纲极显著降低(P<0.01)，丹毒丝菌纲和梭杆菌纲显著降低(P<0.05).黄芪多糖组拟杆菌纲和梭菌纲与对照组相比差异不显著(P>0.05).

表4 肠道微生物在纲水平的物种丰度显著性分析

不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；不同大写字母表示差异极显著(P<0.01).

The lowercase letters indicate significant difference(P<0.05)；The uppercase letters indicate extremely significant difference(P<0.01).

2.3.3 科水平上肠道微生物丰度 由表5可知，在科水平上犬肠道微生物组成有13种，其中主要为产碱杆菌科(Alcaligenaceae)、拟杆菌科(Bacteroidaceae)、双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)、梭杆菌科(Fusobacteriaceae)、乳杆菌科(Lactobacillaceae)、丹毒丝菌科(Erysipelotrichaceae)、消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)、普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae).

与对照组相比，黄芪多糖组梭杆菌科极显著降低(P<0.01)；双歧杆菌科和乳杆菌科显著升高(P<0.05)；黄芪多糖低剂量组普雷沃氏菌科显著升高(P<0.01)，高剂量组极显著升高(P<0.01).

表5 肠道微生物在科水平的物种丰度显著性分析

不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；不同大写字母表示差异极显著(P<0.01).

The lowercase letters indicate significant difference(P<0.05)；The uppercase letters indicate extremely significant difference(P<0.01).

2.3.4 属水平上肠道微生物丰度 由表6可知，在属水平上犬肠道微生物组成有26种，其中比重较多的有10种，分别为别样棒菌属(Allobaculum)、拟杆菌属(Bacteroides)、劳特氏菌属(Blautia)、梭菌属(Clostridium)、粪杆菌属(Faecalibacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)、普氏菌属(Prevotella)、萨特氏菌属(Sutterella).

与对照组相比，黄芪多糖组别样棒菌属极显著增加(P<0.01)，劳特氏菌属、乳酸菌属和普氏菌属显著增加(P<0.05)；黄芪多糖低剂量组梭杆菌属显著降低(P<0.05)，高剂量组极显著降低(P<0.01)；黄芪多糖组拟杆菌属、粪杆菌属和萨特氏菌属与对照组相比均无显著差异(P>0.05).

表6 肠道微生物在属水平的物种丰度显著性分析

不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；不同大写字母表示差异极显著(P<0.01).

The lowercase letters indicate significant difference(P<0.05)；The uppercase letters indicate extremely significant difference(P<0.01).

3 讨论

3.1 黄芪多糖对犬盲肠微生物群落多样性的影响

黄芪多糖作为黄芪中含量较高的免疫活性物质之一，能够显著促进机体免疫器官和免疫细胞的发育，提高动物的免疫力和生产性能，在畜禽养殖上可作为1种免疫佐剂被广泛应用.并且多糖作为益生元，可刺激机体肠道中部分益生菌的增值以及代谢水平，调节人体肠道菌群多样性改善机体健康[4].动物肠道中栖息着数量庞大且复杂的菌群，能够维持机体胃肠道系统的生态平衡，进一步促进机体对营养物质的消化和吸收[14-15].并且正常动物体内的微生物群落是重要的肠道保护屏障，对于某些病原微生物的入侵有显著的拮抗作用.本试验采用高通量测序技术对9只犬的新鲜粪便进行测序分析，3组犬盲肠9个样品中共获得885 399条高质量的细菌16S rDNA 序列.Alpha多样性分析和PCA分析显示，各组覆盖率均大于0.999，说明本次试验测序结果已基本覆盖所有样本，证实了试验数据的有效性，另外饲喂黄芪多糖组Chao指数、ACE指数、Shannon指数均高于对照组，而Simpon指数小于对照组，这说明随着饲粮中黄芪多糖含量的增加，犬盲肠内微生物数量和群落多样性也在升高，且黄芪多糖组犬肠道菌群组成更为相似.甄玉国等[16]研究发现黄芪多糖可提高断奶仔猪盲肠菌群细菌数量，与本试验结果相一致.

3.2 黄芪多糖对犬盲肠微生物群落结构的影响

通过高通量测序技术发现，饲喂黄芪多糖后犬盲肠内菌群结构发生改变，在门水平上的优势菌门主要为放线菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、梭杆菌门、变形菌门.Norouzi等[17]研究发现放线菌可抵抗多种抗耐药性病原微生物，属于潜在益生菌.厚壁菌门的部分细菌能促进多糖在肠道中充分发酵，维持动物肠道健康，提高免疫[18].梭杆菌门内细菌大部分为条件致病菌，一定情况下会导致某些疾病的发生.变形菌门包括大肠杆菌、沙门氏菌、霍乱弧菌、幽门螺杆菌等，多数为病原菌，易引起疾病损害机体健康.与对照组相比，饲喂黄芪多糖组犬肠道内放线菌门、厚壁菌门细菌所占比例显著增加，变形菌门显著降低；梭杆菌门有降低趋势，这与贺琴等[19]研究结果相似.在纲水平上，放线菌纲和芽孢杆菌纲显著升高，β-变形菌纲、丹毒丝菌纲和梭杆菌纲显著降低.

在科水平上，梭杆菌科显著降低，双歧杆菌科、乳杆菌科和普雷沃氏菌科显著升高；在属水平上，别样棒菌属、劳特氏菌属、乳酸菌属和普氏菌属显著增加；梭杆菌属显著降低，与李树鹏等[20]试验结果相一致.王学智等[21]发现一定剂量和浓度的黄芪粗多糖在体外有利于鸡肠道部分细菌增值，主要为乳杆菌和双歧杆菌.有研究发现梭杆菌属主要与结直肠癌有关[22]，结直肠癌患者肠道中梭杆菌属细菌数量较正常人显著上升，本研究结果显示梭杆菌属细菌数量有所降低，可能与黄芪多糖有显著的抗癌、抗肿瘤作用有关.普雷沃氏菌科主要功能是分解淀粉、粘蛋白以及半纤维素等代谢产物，同时可产生短链脂肪酸[23].肠道中有益菌大多可产生短链脂肪酸，短链脂肪酸作用有抗炎、保护肠黏膜功能、调节代谢水平和免疫功能等作用，能产生短链脂肪酸的细菌主要有劳特氏菌属、别样棒菌属、普氏菌属、乳酸菌属等.肠道中有害菌大多会产生内毒素，肠道中内毒素含量上升会引起肠道炎症反应、肠黏膜功能紊乱、代谢失衡和免疫失调等一系列疾病，能产生内毒素的细菌主要包括变形菌门以及梭杆菌门的细菌[24-25].同时，多糖也可被肠道内微生物分解为短链脂肪酸，主要为乙酸、丙酸和丁酸，肠上皮细胞可将多糖降解的丁酸重新利用，调控肠上皮细胞和肠上皮间淋巴细胞的增值和凋亡，且代谢产生的酸性物质可以维持肠道内酸性环境[26-27].低pH环境对部分病原微生物的生长非常不利，有害微生物的生存条件更加困难，病原微生物入侵肠道导致肠道疾病的风险显著降低，从侧面保护了肠黏膜免疫屏障的完整性.

4 结论

在犬日粮中添加黄芪多糖在一定时间内可使犬肠道内菌群数量增多，多样性上升，且黄芪多糖可使肠道菌群结构发生变化，益生菌所占比例增加，条件致病菌比例下降，从而加强肠道的保护屏障，调节机体的免疫力.而黄芪多糖低剂量组与高剂量组盲肠菌群数量、多样性和群落组成结构无明显差异.