诃子酸抗肾间质纤维化的作用及机制研究

柳敏娜，王谨涵，潘 刚，刘天龙，丁 一，席春生

肾间质纤维化是各种慢性肾脏病进展至终末期的共同病理表现，以肌成纤维细胞的增殖及细胞外基质过度沉积为主要特征，导致肾脏功能随时间进行性下降[1-2]。目前，在临床上没有针对肾脏纤维化有效的治疗方法。因此，寻找新型安全高效的药物防治肾间质纤维化和肾功能进展是临床亟待解决的重大问题。传统中药能在机体组织修复过程中发挥良好的治疗作用。诃子是使君子科植物诃子或绒毛诃子的干燥成熟果实，其作为药物最早记载于《唐本草》，在藏药学经典著作《晶珠本草》中被称为“藏药之王”[3]。以诃子为主要成分的中成药十味诃子片是临床治疗肾炎的常用药之一[4]。另有研究表明，诃子药效成分对肝纤维化有显著抑制作用[5]。本研究以单侧输尿管结扎(UUO)和肾小管上皮细胞缺氧处理制作肾间质纤维化的小鼠和细胞模型，探讨诃子药效成分诃子酸(C41H32O27)对肾间质纤维化的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1实验动物与试剂 SPF级雄性C57/BL小鼠购自空军军医大学实验动物中心，饲养环境为温度(20±2)℃，湿度45%～60%，小鼠自由饮水、进食。本实验经动物实验伦理委员会批准。人肾小管上皮HK-2细胞购自美国ATCC细胞库。诃子酸(CAS号：18942-26-2)购自成都普瑞法科技开发有限公司。血尿素氮(BUN)和肌酐(Scr)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。转化生长因子-β1(TGF-β1)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)抗体购自美国Cell Signaling Technology公司。Klotho、成纤维细胞生长因子2(FGF2)抗体购自美国Abcam公司。

1.2实验方法

1.2.1小鼠肾间质纤维化模型制作及给药：根据随机数字表将36只小鼠分为假手术组、模型组和诃子酸组，每组12只。模型组和诃子酸组行单侧输尿管结扎术制作肾间质纤维化模型。主要步骤：3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠，仰卧位固定后，打开左下侧腹腔，分离并结扎左侧输尿管后缝合腹腔。假手术组小鼠只分离输尿管不结扎。造模结束后诃子酸组给予50 mg/kg的诃子酸灌胃治疗，假手术组和模型组给予同等体积的生理盐水灌胃。每天上午固定时间给药1次，给药21 d后处死取材检测。

1.2.2生化指标及肾脏质量指数检测：每组取6只小鼠麻醉后摘眼球取血，常温下3000 r/min离心10 min后获取血清。分别按照试剂盒操作说明检测血清BUN和Scr水平。小鼠处死后，剥离左侧肾脏，并进行称重，肾脏重量与处死前小鼠体重之比即为小鼠的肾脏质量指数。

1.2.3肾脏病理学观察：小鼠麻醉后，用生理盐水和多聚甲醛分别进行灌注固定。肾脏剥离后继续放入多聚甲醛固定24 h。石蜡包埋处理后切片(5 μm)，组织切片根据实验目的分别进行常规HE染色和Masson染色。病理学结果由不了解实验分组的病理医师判读。每张切片随机选取肾脏皮质区域6个视野(×200)观察。

1.2.4免疫组织化学检测：石蜡包埋的肾脏组织切片后脱蜡脱水处理，用0.3%甲醇-过氧化氢灭活内源性过氧化物酶，用枸橼酸抗原修复液修复抗原并用血清封闭。根据实验目的分别滴加anti-TGF-β1(1∶200)和anti-α-SMA(1∶200)抗体后，在4℃冰箱孵育过夜。滴加二抗后室温孵育1 h。滴加DAB显色，苏木素复染。显微镜下在肾皮质层随机选择5个视野拍照。以前期研究中明确的TGF-β1和α-SMA高表达肾间质纤维化小鼠肾脏组织样本为阳性判别标准[6]。

1.2.5Western blot检测：提取肾脏皮质中的总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。同体积的样本加入SDS-PAGE凝胶中电泳分离蛋白，随后用半干法将蛋白转移到甲醇活化的PVDF膜上。5%脱脂奶粉封闭1 h后加入anti-Klotho(1∶100)和anti-FGF2(1∶1000)抗体，4℃过夜孵育。二抗室温孵育1 h后用ECL法显色。条带用Quantity One系统曝光拍照。

1.2.6细胞模型制作及给药：人肾小管上皮HK-2细胞分为对照组、缺氧组、给药组，均用DMEM培养基在37℃孵箱中进行常规培养(37℃，21% O2，5% CO2)。缺氧组和给药组细胞转入三气培养箱中缺氧培养(1% O2，5% CO2)48 h。给药组细胞在培养基中加入50 μg/ml的诃子酸进行处理。

1.2.7细胞活力及乳酸脱氢酶(LDH)测定：细胞活力用MTT法检测，主要操作步骤为3组细胞接种于96孔板，造模给药处理结束后，更换无血清培养基，加入0.5%的MTT溶液15 μl，孵育4 h后加入二甲基亚砜100 μl振荡约15 min，酶标仪在490 nm波长处测吸光度值。LDH水平用微板法根据说明书操作，主要步骤为：培养板中依次加入双蒸水、丙酮酸/待测样本、基质缓冲液、辅酶Ⅰ、2，4-二硝基苯肼和NaOH溶液，孵育5 min后在450 nm波长处测吸光度值。

1.2.8细胞转染：Klotho特异性小干扰RNA(siRNA-Klotho)由上海吉凯基因化学技术有限公司合成。根据Lipofectamine 3000转染试剂操作说明，HK-2细胞(1×106个)进行siRNA-Klotho转染作为转染组，24 h后转染组进行缺氧培养和50 μg/ml的诃子酸处理。然后进行Western blot检测4组HK-2细胞的Klotho和FGF2蛋白表达水平。

2 结果

2.1肾脏质量指数、BUN和Scr水平比较 假手术组的肾脏质量指数在正常范围内，而模型组肾脏质量指数较假手术组显著下降，血清BUN和Scr水平较假手术组均显著升高(P<0.05)。诃子酸组肾脏质量指数显著高于模型组，血清BUN和Scr水平显著低于模型组(P<0.05)。见表1。

表1 3组小鼠肾脏质量指数、BUN和Scr水平比较

注：BUN为血尿素氮，Scr为血肌酐；与假手术组比较，aP<0.05；与模型组比较，cP<0.05

2.2肾脏病理学观察 HE染色结果显示，假手术组肾脏组织结构完好，形态正常。模型组肾脏结构分布错乱，出现小管上皮细胞萎缩，小管管腔扩张，肾小球硬化。诃子酸组较模型组病理变化明显缓解。Masson染色结果显示，模型组肾小管间质出现大量蓝色胶原沉积，间质纤维组织增生明显。诃子酸组的纤维化程度较模型组显著降低。见图1。

2.3肾脏组织TGF-β1和α-SMA免疫组织化学检测 假手术组肾脏组织TGF-β1和α-SMA表达较低。模型组肾小管、间质可见大量的TGF-β1表达和α-SMA沉积。诃子酸组TGF-β1和α-SMA表达水平较模型组显著降低。见图2。

图1 3组小鼠肾脏组织的HE和Masson染色结果(×200)

图2 3组小鼠肾脏组织TGF-β1和α-SMA免疫组织化学染色(×200)TGF-β1为转化生长因子-β1，α-SMA为α-平滑肌肌动蛋白

2.4肾脏Klotho和FGF2蛋白表达水平 Western blot检测结果表明，模型组肾脏组织Klotho蛋白表达水平较假手术组显著下降，FGF2蛋白表达水平较假手术组显著升高(P<0.05)。诃子酸组肾脏组织Klotho蛋白表达水平显著高于模型组，FGF2蛋白表达水平显著低于模型组(P<0.05)。见图3。

图3 3组小鼠肾脏组织Klotho和FGF2蛋白表达FGF2为成纤维细胞生长因子2；与假手术组比较，aP<0.05；与模型组比较，cP<0.05

2.5HK-2细胞活力和LDH水平比较 细胞活力实验表明，缺氧组的细胞活力较对照组显著下降，而LDH水平较对照组显著升高(P<0.05)。给药组的细胞活力显著高于缺氧组，LDH水平显著低于缺氧组(P<0.05)。见图4。

2.6HK-2细胞Klotho和FGF2蛋白表达水平 Western blot检测结果表明，缺氧组的Klotho蛋白表达水平较对照组显著下降，FGF2蛋白表达水平较对照组显著升高(P<0.05)。给药组的Klotho蛋白表达水平显著高于缺氧组，FGF2蛋白表达水平显著低于缺氧组(P<0.05)。转染组的Klotho蛋白表达水平显著低于给药组，FGF2蛋白表达水平显著高于给药组(P<0.05)。见图5。

图4 3组HK-2细胞的细胞活力及乳酸脱氢酶水平比较

与对照组比较，aP<0.05；与缺氧组比较，cP<0.05

图5 4组HK-2细胞的Klotho和FGF2蛋白表达FGF2为成纤维细胞生长因子2；与对照组比较，aP<0.05；与缺氧组比较，cP<0.05；与给药组比较，eP<0.05

3 讨论

随着人口老龄化的加剧以及高血压病、糖尿病等患病率的增加，慢性肾脏病人群也逐年递增，目前其全球发病率为10%～15%[7]，已经成为一种严重威胁人类健康的全球公共卫生问题。诸多研究表明，肾间质纤维化是肾功能逐渐丧失的主要病理因素，且纤维化程度与预后密切相关[8-9]。近年来对肾间质纤维化的分子机制研究有了长足发展，其分子机制也被逐渐揭示，但目前并没有针对性的有效治疗药物[10]。因此，寻找新型安全高效防治肾间质纤维化和延缓肾病进展的药物是临床亟待解决的重大问题[11]。

诃子，又名诃黎、诃黎勒等，在中国古代药典《唐本草》《金匮要略》《千金方》等中均有记载，在中、藏、蒙医药中应用广泛[12]。诃子化学成分复杂，诃子酸是其主要药效成分之一[13]。现代研究表明，诃子提取物有显著的治疗糖尿病和肾脏保护作用。另有研究显示，诃子有效成分可显著抑制四氯化碳诱导的肝纤维化[5]。这提示诃子酸对肾脏纤维化有潜在的治疗作用。本研究中，给予肾纤维化模型小鼠诃子酸治疗后，肾功能和病理学纤维化水平均显著改善，证实了诃子酸的抗肾纤维化作用。

近年来，Klotho蛋白在慢性肾脏病中的重要作用受到越来越多的关注。Klotho是一种抗衰老蛋白，在肾脏组织尤其是近曲小管和远曲小管细胞膜上高表达[14]。在生理情况下，肾脏作为一个重要的调控器官维持Klotho的高水平状态，而在慢性肾脏病患者和动物模型中，Klotho的表达显著降低，且Klotho的降低与疾病进展密切相关[15]。因此，Klotho被认为是慢性肾脏病的重要生物标志物和潜在治疗靶点[16]。据报道，小鼠缺乏Klotho后导致寿命缩短、骨质疏松、认知功能障碍及血管钙化等，过表达Klotho则可延长小鼠寿命，缓解肾脏疾病进展[17]。有研究表明，相比杂合子Klotho小鼠，Klotho敲除小鼠肾脏表型和病理变化明显加重[18]。相反，相比于野生型小鼠，Klotho在小鼠体内的过表达则可导致纤维化相关蛋白(如Ⅳ型胶原蛋白和α-SMA)表达减少[19]。另一项研究提示，Klotho的缺乏可诱导和促进肾小管间质纤维化的进展，而过表达Klotho后可发挥抗肾纤维化的作用[20]。以上研究提示，Klotho作为肾脏纤维化的重要调控蛋白，可能是诃子酸抗肾脏纤维化的关键通路。FGF2是成纤维细胞生长因子家族中的一员，广泛分布在肾脏、心脏、大脑和肝脏等组织[21]。有研究表明，FGF2可通过诱导肌成纤维细胞标志物高表达，加速肾纤维化的发生[22-23]。本研究中，肾间质纤维化模型小鼠和缺氧诱导的HK-2细胞中，均发现Klotho蛋白表达水平降低，FGF2蛋白表达水平升高，而诃子酸给药后可显著逆转Klotho和FGF2蛋白的表达。说明诃子酸可促进Klotho蛋白表达，同时抑制FGF2蛋白的表达。这表明诃子酸的抗肾纤维化作用与Klotho和FGF2密切相关。但Klotho和FGF2之间的上下游调控关系并不明确。有研究发现，肾间质纤维化模型小鼠腹腔注射Klotho后，可显著抑制FGF2的表达，进而缓解纤维化进展[24]。因此，本研究为确认Klotho是否调控FGF2，通过在缺氧和诃子酸处理的HK-2细胞中转染siRNA-Klotho敲减了Klotho的表达。结果发现，转染siRNA-Klotho后，诃子酸对Klotho的促进作用被显著抑制，对FGF2蛋白表达的抑制作用被部分逆转。这表明诃子酸是通过促进Klotho蛋白表达，进而抑制FGF2蛋白表达发挥抗肾间质纤维化作用。

综上所述，诃子酸可显著缓解肾脏纤维化水平、改善肾脏功能，其作用机制可能是通过调控Klotho/FGF2通路发挥作用。诃子酸是抗肾脏纤维化的潜在治疗药物。