香叶木素通过调控p38JNK信号通路对鼻咽癌CNE2细胞凋亡和增殖的影响

周本益，戴 珊，陈 斌

鼻咽癌是我国较为常见的头颈部肿瘤之一，发病主要多见于我国南方和东南亚地区[1]。目前在临床上，鼻咽癌的治疗手段主要以放疗为主、化疗为辅，但是对于复发或转移的鼻咽癌患者而言，化疗更为重要，有时甚至成为治疗的唯一手段[2]。目前有大量临床资料报道，由于鼻咽癌患者早期临床症状并不明显，故在确诊时大部分已至中晚期；而且该类肿瘤具有较高的转移风险，故其治愈率和远期生存率均较低[3-4]。曾有研究数据报道，鼻咽癌患者的5年总生存率可低于50%，严重危及患者的生命安全[5]。为进一步提高鼻咽癌患者的预后生存率，有研究在临床综合治疗中加入适当的辅助药物，以降低患者转移和复发率，提高生存率。香叶木素具有抗氧化、抗炎症、抗过敏、抗肿瘤、植物雌激素作用等多种药理活性，是一种具有良好开发潜力的天然黄酮类化合物[6-7]。目前，国内外有多项实验，在细胞水平和分子水平对香叶木素进行研究[8-9]。本文以鼻咽癌CNE2细胞为研究对象，分析香叶木素的抗肿瘤作用及机制，为临床抗肿瘤辅助药物的研发提供新的思路、方法及依据。

1 材料与方法

1.1主要试剂与仪器 香叶木素(D485000)购于北京百灵威科技有限公司。在干净无菌环境中将香叶木素粉末溶解于二甲基亚砜(DMSO)，配制成100 mmol/L的高浓度储备液，分装后置于-20℃冰箱保存。临用时以磷酸盐缓冲液稀释至所需浓度。胰酶购自美国Gibco公司，DMEM高糖培养基购自美国Gibco公司，氯化钠(分析纯)、氯化钾(分析纯)和磷酸二氢钾(分析纯)均购自国药集团化学试剂有限公司，DMSO购自美国Sigma公司。CO2培养箱(311)购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司，荧光倒置显微镜(X-73P1F)购自奥林巴斯(中国)有限公司，微量振荡器购自海门市其林贝尔仪器制造有限公司，酶标仪(Synergy 2)购自美国Bio-Tek公司，流式细胞仪购自美国BD公司，电泳仪购自美国BIO-RAD公司。

1.2细胞分组 人鼻咽癌CNE2细胞株购自ATCC(美国)。应用血清培养液，在温度为37℃、CO2浓度为5%的培养箱中培养。加入不同浓度香叶木素处理的人鼻咽癌CNE2细胞作为实验组，加入药物溶解介质的人鼻咽癌CNE2细胞作为对照组。

1.3MTT比色法检测鼻咽癌CNE2细胞的生长抑制情况 选取处于对数生长期的鼻咽癌CNE2细胞，加入适量的胰酶使其在CO2培养箱中消化。完成后将其置于倒置显微镜下进行观察，当细胞变小变圆，细胞间出现裂隙时加入新的含血清培养液终止消化，用移液枪轻轻吹打制成单细胞悬液。置于倒置显微镜下使用血球计数板计数，加入新鲜的含血清培养液，制成细胞浓度为1.0×105/ml的单细胞悬液。按照每孔1 ml细胞悬液，接种于96孔板中，置于温度为37℃、CO2浓度为5%的培养箱中孵育过夜。待细胞贴壁后，更换新鲜的含血清培养液，加入稀释好的呈浓度梯度的香叶木素溶液，药物的终浓度为3.125、6.25、12.5、25、50、100 μmol/L，每个浓度3个复孔。对照组加入相同体积的药物溶解介质。加药后，置于37℃、5% CO2培养箱中孵育72 h。将MTT溶液在培养结束前4 h加入到各孔中，每孔50 μl(1 mg/ml)，加入MTT溶液后继续培养4 h。孵育完成后从CO2培养箱中取出96孔板，吸去上清液，每孔加入100 μl的DMSO，微量振荡器室温下振荡10 min，使甲瓒结晶充分溶解。使用酶标仪检测570 nm波长处吸光度值。实验独立重复3次然后进行数据处理，计算出不同浓度香叶木素对鼻咽癌CNE2细胞的生长抑制率。

1.4流式细胞仪检测鼻咽癌CNE2细胞凋亡情况 选取处于对数生长期的鼻咽癌CNE2细胞，按上述方法制成细胞浓度为1.0×105/ml的单细胞悬液。按照每孔1 ml细胞悬液，接种于6孔板中，置于温度为37℃、CO2浓度为5%的培养箱中孵育过夜。分别加入浓度为20、40、60、80和100 μmol/L的香叶木素作为实验组，另外设对照组加入相同体积的药物溶解介质。均在CO2培养箱中培养24 h。药物孵育结束后继续进行染色孵育，然后进行流式细胞仪检测，其中Annexin V-FITC的绿色荧光信号使用FL1通道检测，PI的红色荧光信号使用FL2通道进行检测，最后进行凋亡率的计算分析。

1.5鼻咽癌CNE2细胞周期检测 铺板同细胞凋亡检测相同，鼻咽癌CNE2细胞药物孵育实验中加入浓度为100 μmol/L的香叶木素，分为孵育0 h组、孵育6 h组、孵育18 h组、孵育24 h组、孵育30 h组、孵育42 h组。每组3个复孔。药物孵育实验结束后进行细胞收集、洗涤并固定细胞、染色孵育，最后应用流式细胞仪检测和分析结果。结果数据采用Flowjo软件进行分析。

1.6p38JNK信号通路蛋白表达测定 采用Western Blotting方法检测磷酸化Erkl/2、p38、JNK蛋白的表达，实验组分别加入终浓度为0、12.5、25、50、100和150 μmol/L的香叶木素作为实验组，另外设对照组，加入相同体积的药物溶解介质。所有鼻咽癌CNE2细胞均放入CO2培养箱中培养24 h。然后进行细胞总蛋白提取、蛋白定量测定、制胶、电泳、转膜，进行免疫反应，然后进行显影和定影，最后进行数据处理和图片分析，扫描保存的图片采用Image J分析软件进行灰度分析。

2 结果

2.1生长抑制率比较 对照组细胞的生长抑制率为(0.12±0.01)%，3.125、6.25、12.5、25、50和100 μmol/L浓度香叶木素实验组细胞的生长抑制率分别为(18.24±0.46)%、(29.46±0.95)%、(46.68±2.31)%、(72.46±5.87)%、(76.98±6.05)%、(83.32±7.14)%。不同浓度香叶木素实验组细胞的生长抑制率均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。不同浓度香叶木素对鼻咽癌CNE2细胞的生长具有抑制作用，且随着香叶木素浓度的上升，细胞生长抑制率逐渐上升，呈现浓度依赖性，差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.2细胞凋亡率比较 鼻咽癌CNE2细胞加入香叶木素处理24 h后，对照组细胞凋亡率为(2.41±0.14)%，20、40、60、80和100 μmol/L浓度香叶木素实验组细胞凋亡率分别为(13.26±0.06)%、(25.14±0.14)%、(32.38±0.06)%、(43.52±0.09)%、(55.80±0.19)%。不同浓度香叶木素实验组细胞凋亡率均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。随着香叶木素浓度的增加，鼻咽癌CNE2细胞凋亡率逐渐上升，呈现浓度依赖性，差异均有统计学意义(P<0.05)

2.3香叶木素对鼻咽癌CNE2细胞周期的影响 加入100 μmol/L香叶木素进行处理后，与孵育0 h组比较，孵育6、18、24、30、42 h组G1期细胞比例显著减少，而在G2/M期细胞比例显著增加，且随着加入香叶木素后孵育时间的延长，G1期细胞比例逐渐减少，而G2/M期细胞比例逐渐增加，明显改变了鼻咽癌CNE2细胞的周期分布，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.4磷酸化Erkl/2、p38、JNK蛋白表达水平比较 不同浓度香叶木素对鼻咽癌CNE2细胞磷酸化Erkl/2蛋白含量无明显影响，其含量无明显变化(P>0.05)；而随着香叶木素浓度的增高，p38蛋白与JNK蛋白含量均呈逐渐上升趋势，且呈现浓度依赖性(P<0.01)。见表2、图1。

表1 香叶木素对鼻咽癌CNE2细胞周期的影响

注：与孵育0 h组比较，aP<0.05

表2 不同浓度香叶木素对鼻咽癌CNE2细胞中磷酸化Erkl/2、p38、JNK蛋白表达的影响

图1 不同浓度香叶木素对鼻咽癌CNE2细胞磷酸化Erkl/2、p38与JNK蛋白表达的影响

3 讨论

香叶木素是一种天然的黄酮类化合物，因具有较好的抗氧化、抗菌、抗炎、抗过敏、抗肿瘤和植物雌激素作用，被认为是具有较好开发潜力的天然中草药[10-12]。Androutsopoulos等[13]研究显示，香叶木素对乳腺癌肿瘤细胞MDA-MB-468的增殖具有一定的抑制作用，但对正常乳腺组织细胞无明显影响；该项研究还发现，乳腺癌细胞MDA-MB-468在香叶木素作用一定时间后，细胞周期明显改变，有部分肿瘤细胞被阻滞于G1期，而对于正常乳腺组织细胞而言，并未出现细胞周期阻滞现象。此外，还有学者在肝癌肿瘤细胞的研究中发现，香叶木素可将肝癌HepG2细胞的生长周期阻滞于G2/M期，从而抑制了肝癌细胞的增殖生长，在采用香叶木素处理的肝癌细胞中发现，相关抑癌因子如p53基因、p21蛋白的表达增加，p-ERK和p-JNK蛋白的含量也显著上升[14-15]。因此，有学者认为，香叶木素可能具有广泛抗肿瘤效果，但关于其具体的机制通路还在继续研究当中[16-18]。

本组研究结果显示，香叶木素对鼻咽癌CNE2细胞的生长具有抑制作用，且随着香叶木素浓度的上升，细胞生长抑制率和凋亡率均明显上升，且呈现浓度依赖性。而在细胞周期检测中发现，与孵育0 h组比较，香叶木素孵育的鼻咽癌CNE2细胞在G1期细胞比例显著减少，而在G2/M期细胞比例明显增加，且随着香叶木素孵育时间的延长，G1期细胞比例逐渐减少，G2/M期细胞比例逐渐增加。但在正常生理状态下，由于G0期即细胞静息期时间最长，故位于G0/G1时期细胞比例最高[19]。但本研究结果显示，香叶木素明显明显改变了鼻咽癌CNE2细胞的周期分布，可减少G0/G1期细胞比例，增加G2/M期细胞比例，由此将鼻咽癌CNE2细胞阻滞于G2/M期，抑制其增殖生长，起到抗癌作用。

本研究结果还发现，不同浓度香叶木素均对鼻咽癌CNE2细胞中磷酸化Erkl/2蛋白的表达无明显影响；而随着香叶木素浓度的增加，p38蛋白和JNK蛋白含量的表达均呈现上升趋势。上述结果提示，香叶木素诱导鼻咽癌CNE2细胞凋亡、改变细胞周期而抑制细胞增殖生长可能是通过活化MAPK家族中p38JNK信号通路来实现。有研究表明，p38MAPK蛋白信号通路与细胞周期中G2/M期的阻滞有着一定联系，其主要机制可能是p38MAPK信号通路被激活导致p38蛋白的活化磷酸化，而磷酸化的p38蛋白具有下调Cdc25B活性的作用，而Cdc25B蛋白的活性与Cdc25蛋白活性息息相关，前者的下调也会导致后者的下调，Cdc25又可激活Cdc2蛋白[20-22]。而细胞在G2期向M期的转化过程中，Cdc2和Cyclin B的结合是必不可少的，一旦Cdc2减少，则缺乏与Cyclin B结合以及减少酶的活性，最终导致G2期向M期转化阻滞，从而起到抑制肿瘤细胞增殖生长的作用[23-24]。曾有文献证实，在线粒体调节细胞凋亡的途径中，JNK的激活也起着极为重要的作用[25]。有生物学研究发现，JNK的激活对抑癌基因Bcl-2和Bcl-xl蛋白的表达具有一定的上调作用，在发挥抑癌效果的同时，还可改变线粒体膜电位和细胞色素C的释放，对caspase-9和caspase-3的表达具有上调效果，最终发挥促进细胞凋亡的作用[26-27]。

综上所述，香叶木素可促进鼻咽癌CNE2细胞凋亡，通过改变细胞周期抑制其增殖生长，具有抗肿瘤活性。其机制可能与香叶木素能引起细胞G2/M期阻滞和活化p38JNK信号通路有关。但关于p38JNK信号通路与细胞G2/M期阻滞之间的联系还有待进一步深入研究。