漆酶/天然介体体系漂白硫酸盐竹浆的机理研究

周生飞 詹怀宇 姚向荣 付时雨

（华南理工大学制浆造纸工程国家重点实验室，广东广州，510640）

漆酶/天然介体体系是一种对环境友好的生物反应体系，在制浆造纸中有着重要的应用。在二次纤维回用中，它有助于废纸脱墨，提高脱墨浆的可漂性，同时提高纸浆的裂断长和撕裂指数；在高得率制浆中，它能显著降低能耗，提高成纸强度；在化学法制浆中，它能降低纸浆卡伯值，提高白度；在纸浆漂白中，它能取代传统的含氯漂白，降低有毒和致癌物质的排放量，减少对环境的污染和人类的危害；在造纸废水处理中，它能降解造纸废水中的有毒物质和有色物质。此外，它还能用于改善纸浆纤维性能，提高纸张湿强度等［1］。

笔者曾用羟基苯甲酸、香草酸、对羟基苯甲醛、丁香酸、香草醛、丁香醛、乙酰丁香酮等7种小分子酚醛物质及它们的混合物作为漆酶/介体体系的天然介体，用于硫酸盐法竹浆的漆酶/介体体系漂白，这些体系都能不同程度地促进竹浆最终白度的提高和木素的脱除。然而，漆酶/天然介体体系的漂白机理至今仍不十分明确，很有必要继续深入探讨。本实验对硫酸盐竹浆进行了包含漆酶/天然介体体系漂白段的全无氯漂白，并对各段的残余木素进行了GPC、TGA、FT-IR、1H-NMR和13C-NMR分析，期望通过漆酶/天然介体体系漂白段前后竹浆残余木素的表征，探索漆酶/天然介体体系的漂白机理。

1 实验

1.1 原料和药品

硫酸盐竹浆，初始卡伯值16.0、白度30.3％。

主要药品和试剂：漆酶（通过实验室培养的白腐菌获得），混合纤维素酶（由CMC酶和Avicel酶组成，液体，夏盛公司提供），吡啶（分析纯），醋酸酐（分析纯），THF（色谱纯），KBr（光谱纯），无水乙醇（分析纯），DMSO-d6（含TMS）。

1.2 竹浆的TCF漂白

首先对竹浆进行了TCF漂白，漂序为O-LMS-QP，具体操作条件如下。

氧脱木素（O）：在旋转式反应釜中进行，浆浓10％，NaOH用量4.0％，MgSO4用量0.5％，氧压0.5MPa，温度100℃，时间60min。

漆酶/天然介体体系处理（LMS）：在PARR 4843高压反应釜中进行，所用天然介体为对羟基苯甲酸、香草酸、对羟基苯甲醛、丁香酸、香草醛、丁香醛、乙酰丁香酮等小分子酚醛物质的混合物，浆浓10％，漆酶用量5IU/g，介体用量2％，用醋酸-醋酸钠缓冲溶液调节pH值为4.0，温度50℃，氧压0.5MPa，反应时间120min，搅拌转速150r/min。

螯合处理（Q）：将浆料及化学品密封于塑料袋内，揉搓均匀后置于恒温水浴锅中，浆浓10％，ED-TA用量1.0％，漂终pH值3.0，温度70℃，反应时间60min。

过氧化氢漂白（P）：将浆料及化学品密封于塑料袋内，揉搓均匀后置于恒温水浴锅中，浆浓10％，H2O2用量3.0％，NaOH用量2.0％，MgSO4用量0.05％，EDTA用量0.2％，温度90℃，反应时间150min。

1.3 漂白各段竹浆残余木素的提取

首先用温和的酶水解-酸水解法［2］从竹浆中制备粗木素，然后用乙醚对粗木素进行提纯。

温和的酶水解：将湿润的竹浆置于三角瓶中，加入一定量的去离子水，浆浓约为3％；加入pH值4.8的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，使浆中离子浓度为50mmol/L；加入混合纤维素酶，用量为50FPU/g（绝干浆），然后将三角瓶置于50℃的摇床内，在200r/min下振荡，24h后再次加入酶液，总反应时间为48h。反应结束后，将混浊液在4500r/min下离心10min，得到沉淀。

酸水解：将酶水解得到的沉淀加入到0.05mol/L HCl的二氧六环-水（前者与后者体积比85∶15，下同）中，在通N2保护的情况下微沸（103℃左右，油浴）回流2h；反应液冷却后用G2玻璃滤器过滤，残留固体用二氧六环-水洗涤至无色，合并滤液，在强烈搅拌下用NaHCO3中和；然后将液体缓慢滴入大量pH值为2的水中（水体积是液体体积10倍以上），出现淡黄色沉淀；在4500r/min下离心10min，得到沉淀，用一定体积的二氯甲烷洗涤3次后，冷冻干燥，制得粗木素。

粗木素提纯：将粗木素溶于二氧六环-水中，然后缓慢滴入大量乙醚（10倍体积以上）中，出现淡黄色沉淀；在4500r/min下离心10min，得到沉淀，用乙醚洗涤，冷冻干燥，得到纯化木素。

1.4 木素的乙酰化

将纯化木素置于带塞的三角瓶中，加入足量的吡啶和醋酸酐（前者与后者体积比1∶2），用N2排出三角瓶中的空气，置于暗中反应72h，反应期间不定期振荡。反应结束后，将液体缓慢滴入大量乙醚（10倍体积以上），析出浅黄色的沉淀，即为乙酰化后的木素。离心分离，并用乙醚洗涤乙酰化后的木素至无吡啶味，冷冻干燥备用。

1.5 对木素的分析

木素的分子质量分布在Agilent 1200 series上进行测定，2根凝胶色谱柱为Agilent PL gel 5μm 103Å和500Å，RID检测器，流量1.0mL/min柱温30℃，标线用聚苯乙烯作出，其质均相对分子质量为1490～53500。

木素的TGA分析在TGA Q 500上进行，升温速率为20℃/min。

木素的FT-IR分析在Bruker Tensor 27上进行，采用KBr压片法，扫描次数为16次。

木素的1H-NMR分析和13C-NMR分析是先将乙酰化的木素溶于DMSO-d6（含TMS）中，然后在Bruker AV400 NMR上进行。

2 结果与讨论

2.1 竹浆木素的GPC分析

漂白各段竹浆残余木素的GPC分析结果如表1所示。由表1可知，经O段处理后，残余木素的质均分子质量略有增加，而经LMS段处理后，残余木素的质均分子质量明显变小，说明残余木素在漂白过程中的总体变化趋势是质均分子质量变小。残余木素分子质量分布经O段处理后，多分散性变小，说明分子质量分布变窄；经LMS段处理后，残余木素的分子质量分布反而变得更为分散。

表1 漂白各段竹浆残余木素的相对分子质量

2.2 竹浆木素的TGA分析

O段和LMS段残余木素的热重（TG）曲线及微分（DTG）曲线见图1。

图1 O段/LMS段残余木素的TG和DTG曲线

由图1a可知，O段残余木素的热解过程分为3个区段：温度＜210℃时，微分曲线在200.3℃处出现第一个失重峰，主要是样品中所含水分的去除；在210～600℃范围内，木素发生明显热解，微分曲线在338.2℃处有较大失重峰，这个峰区间为木素的主要热解阶段，木素失重达56.2％，600℃处木素的残余质量为31.6％；温度＞600℃，热重曲线平缓，微分曲线在650℃附近出现小的失重峰，为木素的二次热解。

由图1b可知，LMS段残余木素的热解过程也分为3个区段：温度＜159.5℃时，微分曲线在139.1℃处出现一个失重峰，主要是样品中所含水分的去除；159.5～600℃为木素热解的主要区间，木素发生明显热解，微分曲线在194℃处有一个失重峰肩，在245.3℃和335.1℃处有2个主要的失重峰；木素在159.5～298℃峰区间的失重为22.9％，在298～600℃峰区间的失重为25.8％，600℃处木素的残余质量为34.1％；温度＞600℃，热重曲线平缓，微分曲线无失重峰。

综上所述，在LMS段处理前后，竹浆残余木素的热解行为明显不同。LMS段前残余木素仅在338.2℃处有一主要的失重峰，LMS段后残余木素除了在该处附近的335.1℃处有一个主要的失重峰外，还在较低温度245.3℃处出现一个更大的失重峰。可见，经LMS段后，竹浆残余木素的热稳定性变差，更易在较低温度下热解。

2.3 竹浆木素的FT-IR分析

图2为LMS段残余木素的FT-IR，各个吸收峰根据参考文献［3-9］确定，其归属见表2。

图2 LMS段残余木素的FT-IR

表2 竹浆残余木素FT-IR吸收峰的归属

3470cm-1说明原浆木素、O段和LMS段残余木素中均存在一定量的游离脂肪族羟基；3130cm-1说明原浆木素和LMS段残余木素中存在游离酚羟基，而O段残余木素中几乎没有游离酚羟基；3080cm-1说明O段残余木素中有少量—COOH。对于原浆木素和LMS段残余木素，3130cm-1比3470cm-1强，说明游离酚羟基比脂肪族羟基多。2940cm-1附近为CH3、CH2、CH的C—H伸缩振动，原浆木素和LMS段残余木素在此处的吸收类似，但是O段残余木素的CH3吸收显著减弱，说明O段中大量的—OCH3被脱除。1767cm-1为芳香乙酰基，1718cm-1为脂肪乙酰基，原浆木素在1767cm-1处有大的吸收峰，说明原浆木素中主要为酚羟基，脂肪族羟基少；O段残余木素在1743cm-1有大的吸收峰，处于1767～1718cm-1之间，说明乙酰化的酚羟基和脂肪族羟基的含量相当，结合3130cm-1处无游离酚羟基，说明O段残余木素脂肪族羟基比酚羟基稍多；LMS段残余木素在1743cm-1处有大的吸收峰且峰肩向1767cm-1延伸，说明LMS段残余木素以脂肪族羟基为主。综上所述，原浆木素羟基以酚羟基为主，O段残余木素中脂肪族羟基比酚羟基稍多，而LMS段残余木素则以脂肪族羟基为主，说明木素在O段和LMS段中，苯环被持续破坏，导致酚羟基减少，脂肪族羟基增多。

1685～1652cm-1为共轭CO的吸收，1685cm-1为共轭醛CO，1652cm-1为共轭酮CO；原浆木素中1685cm-1处和1652cm-1处的吸收相当，O段残余木素相对原浆木素在1652cm-1处的吸收增强，LMS段残余木素相对O段残余木素在1685cm-1处的吸收又增强，说明漂白过程中木素先生成共轭酮，然后又生成共轭醛。

对于原浆木素，在1465～1458cm-1、1418cm-1、1400cm-1处为愈创木基（G）上—OCH3的C—H弯曲振动，在1385cm-1、1372cm-1、1338～1331cm-1处为紫丁香基（S）上—OCH3的C—H弯曲振动；原浆木素中G单元—OCH3的吸收比S单元—OCH3的吸收略强，可得G与S的摩尔比大于2∶1，即S单元占木素结构单元的比例不到1/3（以物质的量计），竹子原浆木素的主要结构单元为G单元。

对于LMS段残余木素，在1465～1455cm-1、1419cm-1、1400cm-1处为G单元上—OCH3的C—H弯曲振动，在1385cm-1、1372cm-1、1333cm-1处为S单元上—OCH3的C—H弯曲振动；G单元的吸收比S单元稍弱，可得G与S的摩尔比小于2∶1，G单元仍为主要结构单元，但S单元占木素结构单元的比例相对原浆木素稍多，即经LMS段后，残余木素中S单元的含量增多。

在1045cm-1处为CC—O的C—O，在1013cm-1处为Ar-O的C—O，原浆木素和O段残余木素在该两处的吸收类似，LMS段残余木素在1045cm-1处吸收比原浆木素和O段残余竹浆木素强，而在1013cm-1处变弱，说明LMS段中，木素苯环被破坏，苯环转变成脂肪链。

2.4 竹浆木素的1H-NMR分析

图3 O段/LMS段残余木素的1H-NMR图

表3 O段/LMS段残余木素1H-NMR谱共振峰的归属

O段和LMS段残余木素的1H-NMR图如图3所示，图3中各峰的归属根据参考文献［8-12］确定（见表3）。由表3可知，8#～13#峰为苯环质子的共振，5#～7#峰为—OCH3的质子共振。由8#～13#峰可知，这2种木素中都含有愈创木基（G）、紫丁香基（S）和对羟基苯基（H）这3种苯丙烷结构单元，LMS段前后竹浆残余木素为GSH型。1#峰和2#峰为脂肪乙酰基，3#峰为芳香乙酰基，O段残余木素中，1#峰和2#峰积分面积之和与3#峰积分面积之比为2.5∶1，LMS段残余木素中，它们的积分面积之比为3∶1，说明经LMS段后，脂肪乙酰基增多，即残余木素中脂肪族羟基增多，这是由于经LMS段后竹浆残余木素的破坏增多。5#峰为脂肪链—OCH3，6#峰和7#峰为苯环—OCH3，O段残余木素中以7#峰为主，而LMS段残余木素中以5#峰为主，说明LMS段残余木素中脂肪链—OCH3比O段残余木素的多、苯环—OCH3比O段残余木素的少，这是由于LMS段中木素破坏增加。

图4是O段和LMS段残余木素苯环质子区的比较，从O段到LMS段，代表G单元和S单元的峰的面积之比G/S和G’/S’均变大，说明经LMS段后，竹浆残余木素S单元相对含量增多；H/G和H’/G’之比均变小，说明经LMS段后，竹浆残余木素H单元相对含量减少。可见，漆酶/天然介体体系漂白对竹浆木素S单元的破坏较少，而对H单元的破坏和去除则较多。

图4 O段/LMS段竹浆残余木素1H-NMR的苯环质子区

对1H-NMR谱的相关区域进行积分，可以由积分面积计算出竹浆残余木素中主要基团的摩尔比，如表4所示。经LMS段后，残余木素每个苯丙烷单元对应的甲氧基数增多，这是因为在LMS段中部分苯环被破坏后残留在竹浆中，导致苯环数量减少，然而甲氧基却仍然保留；苯丙烷单元对应的脂肪族羟基显著增加，也说明LMS段中木素的苯环被进一步氧化破坏。

表4 木素中各基团的摩尔比

2.5 竹浆木素的13C-NMR分析

LMS段前后竹浆残余木素的13C-NMR谱如图5和图6所示，各峰的归属根据参考文献［4-5，9，11-15］确定（见表5）。

如图5所示，对于O段残余木素，1#峰为脂肪乙酰基的CO，2#峰为芳香乙酰基的CO，前者与后者的积分面积之比大于1，可见，在O段残余木素中，同时存在脂肪族羟基和酚羟基，脂肪族羟基的含量比酚羟基多。3#峰为酯化紫丁香基（S）的C-3和C-5的共振，4#峰为愈创木基（G）的C-3的共振，6#峰为愈创木基（G）的C-4的共振，7#峰为对羟基苯基（H）的C-4的共振，说明O段残余木素为GSH型，由3#峰、6#峰与7#峰的积分面积比为1∶2∶1可得，苯丙烷单元S、G、H的摩尔比为0.5∶2∶1（3#峰由2个C的共振产生，而6#峰和7#峰由1个C的共振产生），即O段残余木素以G单元为主，H单元含量多于S单元含量，说明在O段中—OCH3被大量脱除。

如图6所示，在LMS段残余木素中，1#峰与2#峰积分面积之比为1∶0.07，比值远远大于1，可见，同时存在脂肪族羟基和酚羟基，且以脂肪族羟基为主，酚羟基非常少。3#峰～7#峰、9#峰～11#峰为苯环C的共振，可知LMS段残余木素为GSH型。由化学位移为143.6（H）、148.0～149.7（G）、152.6（S）处的积分得，H、G、S的摩尔比为1∶4.94∶2.78。可见，LMS段残余木素以G为主；相对于O段残余木素，LMS段残余木素S单元增加，H单元减少，与前文FT-IR和13C-NMR的分析结果一致。

从图6的化学位移为75.3、63.2、62.0、60.7和59.3可知，木素单元之间的连接方式主要有β-1’，β-O-4’和β-5’，它们的积分面积比为1∶2.38∶0.26，则β-1’、β-O-4’和β-5’3种主要连接方式的摩尔分数（只考虑这3种连接时）依次为27.5％、65.4％、7.1％。在Sakakibara提出的由28个苯丙烷单元构成的针叶木木素的结构模型中，以β-O-4’连接为主，且有3个β-1’和4个β-5’连接；而Nimz提出的由25个苯丙烷单元构成的阔叶木木素模型中，β-1’连接为3个，β-5’连接仅有2个［16］。竹子作为禾本科植物，除以β-O-4’为主的连接外，还有较多的β-1’连接，而β-5’连接较少，这是合理的。

表5 LMS段前后竹浆残余木素13C-NMR谱中各峰归属

综上所述，竹浆残余木素中脂肪族羟基多于酚羟基，LMS段残余木素酚羟基很少。竹浆木素为GSH型，结构单元以G单元为主，O段残余木素中G＞H＞S（以物质的量计，下同），LMS段残余木素中G＞S＞H，说明经LMS段后，竹浆木素中S单元增多。苯丙烷单元之间的连接以β-O-4’为主，且有β-1’和β-5’连接，经LMS段后，竹浆木素中β-1’连接的含量增加，而β-5’连接很少。经LMS段后，竹浆残余木素的破坏加剧，脂肪族羟基增加，H单元的含量减少，G单元的含量略有减少，S单元的含量从27％增至31.9％。

3 结论

3.1 采用GPC分析了硫酸盐竹浆木素、O段和LMS段的残余木素。结果表明，原浆木素的质均相对分子质量为11010、O段残余木素的为12150、LMS段残余木素的为7374，多分散性依次为1.49、1.03和2.38，可见，随漂白（O、LMS）的进行，竹浆残余木素的总体变化趋势为分子质量降低。

3.2 采用TGA分析了O段和LMS段残余木素。结果表明，O段残余木素在338.2℃处有1个主要的失重峰，而LMS段残余木素在335.1℃处和245.3℃处有2个主要的失重峰。可见，经LMS段处理后，竹浆残余木素的热稳定性变差，更易在较低温度下热解。

3.3 采用FT-IR和1H-NMR分析了原浆木素、O段和LMS段残余木素。采用13C-NMR分析了O段和LMS段残余木素。结果表明，竹浆木素为GSH型，结构单元以G为主，苯丙烷单元之间的连接以β-O-4’为主，此外还有β-1’和β-5’连接。原浆木素中，羟基以酚羟基为主，苯丙烷单元中S的含量（以物质的量计，下同）少于1/3；O段残余木素中，脂肪族羟基比酚羟基多，并有少量—COOH、—OCH3脱除，苯丙烷单元中G＞H＞S；LMS段残余木素中，羟基以脂肪族羟基为主，S单元含量增加，H单元含量减少，β-1’连接增加，β-5’连接减少。综上所述，随漂白（O、LMS）的进行，—OCH3被脱除，苯环被破坏，脂肪族羟基增多；经LMS段后，竹浆残余木素中S单元增加，H单元减少。

［1］张爱萍，秦梦华，徐清华.漆酶在制浆造纸中的应用研究进展［J］.中国造纸学报，2004，19（2）：161.

［2］Argyropoulos D S，Sun Y，Palus E.Isolation of residual Kraft lignin in high yield and purity［J］.J Pulp Pap Sci，2002，28（2）：50.

［3］Lawther J M，Sun R C，Banks W B.Rapid isolation andstructural characterization of alkali-soluble ligninsduring alkaline treatment and atmospheric refining of wheat straw［J］.Industrial Crops and Products，1996（5）：97.

［4］Fernández-Bolaños J，Felizón B，Heredia A，et al.Characterization of the lignin obtained by alkaline delignificationand of the cellulose residue from steam-exploded olive stones［J］.Bioresource Technology，1999，68：121.

［5］Sun R C，Tomkinson J，Wang S Q，et al.Characterization of lignins from wheat straw by alkalineperoxide treatment［J］.Polymer Degradation and Stability，2000，67：101.

［6］付时雨.生物漂白过程木素结构的红外光谱分析［J］.纤维素科学与技术，2000，8（2）：30.

［7］泉美治，小川雅弥，加藤俊二，等.仪器分析导论：第4册［M］.2版.李春鸿，刘振海，译.北京：化学工业出版社，2005：1.

［8］Ibrahim M N M，Norhidaya Z，Sipaut C S，et al.Chemical and thermal properties of lignins from oilpalm biomass as a substitute for phenol in a phenolformaldehyde resin production［J］.Carbohydrate Polymers，2011，86（1）：112.

［9］Sun X F，Jing Z，Fowler P，et al.Structural characterization and isolation of lignin and hemicelluloses from barley straw［J］.Industrial Crops and Products，2011，33：588.

［10］García A，Toledano A，Serrano L，et al.Characterization of lignins obtained by selective precipitation［J］.Separation and Purification Technology，2009，68：193.

［11］Oliveira L，Evtuguin D，Cordeiro N，et al.Structural characterization of stalk lignin from banana plant［J］.Industrial Crops and Products，2009，29：86.

［12］She D，Xu F，Geng Z C，et al.Physicochemical characterization of extracted lignin from sweet sorghum stem［J］.Industrial Crops and Products，2010，32：21.

［13］Sealey J，Ragauskas A J.Residual lignin studies oflaccase-delignifiedkraftpulps［J］.Enzyme and Microbial Technology，1998，23：422.

［14］Ghatak H R.Spectroscopic comparison of lignin separated by electrolysisand acid precipitation of wheat straw soda black liquor［J］.Industrial Crops and Products，2008，28：206.

［15］Hage R E，Brosse N，Chrusciel L.Characterization of milled wood lignin and ethanol organosolv ligninfrom miscanthus［J］.Polymer Degradation and Stability，2009，94：1632.

［16］詹怀宇，李志强，蔡再生.纤维化学与物理［M］.北京：科学出版社，2005：272.