灵芝孢子提取物对肺腺癌细胞顺铂化疗敏感性及TAZ表达的影响

王 伟，郭 雯，董海北，许猛军，马高磊，吴小进

非小细胞肺癌(NSCLC)约占肺癌的80%，尽管对其治疗取得了一定的进步，但晚期NSCLC患者的预后仍然很差[1-2]。自靶向治疗出现以来，晚期NSCLC的治疗方法可能会发生变化，但基于顺铂的双线药物仍然是大多数晚期NSCLC患者治疗的基础，肺腺癌在NSCLC中占比最高。而对顺铂药物的抗性已经成为影响肺癌治疗效果的主要因素。为了克服耐药性，已采用二线或联合化疗方案，但NSCLC中各种化疗的总体生存获益尚不令人满意[3-4]。灵芝孢子提取物含有大量多糖、三萜类化合物、黄酮类化合物、香豆素、醌、类胡萝卜素、氨基酸，具有免疫调节、抗病毒、抗氧化、抗菌、抗癌等作用。近期研究发现，灵芝孢子提取物具有抗肿瘤和免疫调节作用，是结肠癌、早幼粒细胞白血病、胃癌等各种癌细胞的体外抑制剂[5-6]。具有PDZ结合域的转录共激活因子(transcriptional coactivator with PDZ-binding motif, TAZ)是Hippo途径的关键转导因子，该途径是器官大小、干细胞维持和肿瘤发生的重要调节剂。TAZ主要通过TEAD转录因子家族来刺激促进细胞增殖和控制器官大小基因的表达[7]。最近的研究一致表明，TAZ和(或)其旁系同源YAP的上调赋予了对多种细胞毒剂如抗微管蛋白、抗代谢物和DNA破坏剂的抗性[8]。已有研究证明，TAZ在乳腺癌细胞中过表达诱导对紫杉醇和阿霉素的耐药性，其靶基因CYR61和CTGF的上调有助于耐药性的发展[9]。本研究拟探讨灵芝孢子提取物对肺腺癌H1299细胞顺铂化疗敏感性及TAZ表达的影响，为肺腺癌的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1主要试剂及仪器 10%胎牛血清、Trizol试剂(美国Invitrogen公司，批号：R6081、R2078)；灵芝孢子提取物、DMEM培养基、RIPA缓冲液、聚偏氟乙烯膜(美国sigma公司，批号：S05167、S10262、S11825、S09156)；顺铂、细胞计数试剂盒8(CCK-8)、结晶紫染液(碧云天生物技术研究所，批号：181026、181022、181103)；4%多聚甲醛、化学发光检测试剂(德国默克公司，批号：DM4419、DM5013)；Annexin V-Alexa Fluor 647/PI细胞凋亡检测试剂盒(南京福麦斯生物技术有限公司，批号：M0917)；Transwell室(美国Chemicon公司，批号：CA55671)；SYBR®PrimeScript®PLUS RT-RNA PCR试剂盒(宝生物工程大连有限公司，批号：B0816)；10%聚丙烯酰胺凝胶电泳(美国赛默飞世尔科技公司，批号：MS66179)；抗TAZ抗体、抗GAPDH抗体(美国CST公司，批号：C6317、C7059)；辣根过氧化物酶偶联的二抗(美国Abcam公司，批号：ab09486)。ELx800酶标仪(美国Bio-Tek公司)；奥林巴斯BX43显微镜(日本奥林巴斯公司)；AS-90流式细胞仪(美国赛默飞世尔科技公司)；ABI7500实时PCR检测系统(美国通用公司)；Molecular Imager系统(美国Bio-Rad公司)；数字图像分析系统(美国Media Cybernetics公司)。

1.2细胞培养 肺腺癌H1299细胞购自中国科学院(上海)细胞库，细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养，培养环境为37℃以及5% CO2。

1.3细胞分组 H1299细胞组如前所述常规培养，不做任何处理；顺铂组的培养方法同H1299细胞组，加入顺铂，使顺铂最终浓度为40.0 μg/ml(预实验顺铂对H1299细胞的半数致死浓度为80.0 μg/ml，以1/2半数致死浓度为作用剂量)；灵芝孢子提取物组培养方法同H1299细胞组，加入灵芝孢子提取物，使灵芝孢子提取物最终浓度为80.0 μg/ml(预实验灵芝孢子提取物对H1299细胞的半数致死浓度为160.0 μg/ml，以1/2半数致死浓度为作用剂量)；联合组的培养方法同H1299细胞组，加入顺铂40.0 μg/ml以及灵芝孢子提取物80.0 μg/ml；上述各组细胞置于CO2培养箱(37℃、5% CO2、2% O2、93% N2)培养。以上各组每孔设6个平行样，培养72 h。

1.4细胞增殖及单克隆形成数目测定 CCK-8检测试剂盒用于检测细胞增殖，根据试剂说明书的操作方法，收集培养结束时各组H1299细胞，使用ELx800酶标仪在450 nm波长测量OD值。细胞存活率=(实验组OD-空白组OD)/(对照组OD-空白组OD)×100%。细胞克隆形成测定，收集培养结束的各组H1299细胞接种在6孔板(1×103个/孔)中，并培养10 d。每3天更换1次培养基，用4%多聚甲醛固定细胞，并用结晶紫染色，在显微镜下计算细胞克隆形成数目。

1.5细胞凋亡测定 Annexin V-Alexa Fluor 647/PI细胞凋亡检测试剂盒用于检测细胞凋亡，各组H1299细胞培养结束后，用胶原酶消化细胞，收集细胞并将其重悬于结合缓冲液中，将细胞用膜联蛋白V-Alexa Fluor 647和PI染色，然后在室温下孵育15 min，使用AS-90流式细胞仪分析细胞凋亡率。

1.6细胞侵袭迁移能力测定 ①细胞侵袭测定通过使用带有8 μm孔径插入物的Transwell室进行。在200 μl无血清培养基中将各组H1299细胞(2×104个)接种到顶室中，并将600 μl完全培养基添加到底室。培养12及24 h后，分别将细胞用4%多聚甲醛固定并用结晶紫染色。从5个随机选择的区域计数穿膜细胞数，然后取平均值。②伤口愈合试验测定迁移率，将各组H1299细胞接种在6孔板上，加入无血清培养基再孵育24 h，用200 μl移液器钝头在每个孔中进行一次刮擦，使用倒置显微镜在12 h后对细胞进行成像。使用Image J 1.47软件计算伤口闭合的百分比(迁移率)。

1.7细胞TAZ mRNA水平的检测 使用Trizol试剂提取培养结束时H1299细胞的总RNA。实时PCR分析使用SYBR®PrimeScript®PLUS RT-RNA PCR试剂盒，使用2-ΔΔCt方法计算TAZ的总倍数变化。应用ABI7500实时PCR检测系统，QRT-PCR在95℃进行15 s，然后在95℃进行5 s，在60℃进行34 s，共40个循环。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。所用的引物序列如下，TAZ正向：5'-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3'，TAZ反向：5'-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3'；U6正向：5'-ATGCGAGTTGTTCTCCGTCT-3'，U6反向：5'-TATCTGCGGTTTCCTCAAGC-3'。

1.8细胞TAZ蛋白水平的检测 在含有新鲜蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物的RIPA缓冲液中裂解细胞。蛋白质通过10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并转移到聚偏氟乙烯膜上。将膜在5%脱脂奶中封闭，并加入抗TAZ抗体(1∶1000稀释)，抗GAPDH抗体(1∶2000稀释)，在4℃下孵育过夜。GAPDH用作内源对照。然后加入辣根过氧化物酶偶联的二抗(1∶1000稀释)，在室温下孵育2 h，使用增强的化学发光检测试剂对蛋白印迹进行显影，并使用Molecular Imager系统进行扫描。通过数字图像分析系统(Image Pro Plus版本6.0)对图像进行定量分析。进行3次重复实验。

2 结果

2.1OD值和存活率比较 与H1299细胞组比较，顺铂组、灵芝孢子提取物组、联合组的OD值和存活率明显降低(P<0.05)。与顺铂组和灵芝孢子提取物组比较，联合组的OD值和存活率明显降低(P<0.05)。见表1。

表1 4组肺腺癌H1299细胞的OD值和存活率比较

注：与H1299细胞组比较，aP<0.05；与顺铂组比较，cP<0.05；与灵芝孢子提取物组比较，eP<0.05

2.2细胞克隆形成数目比较 H1299细胞组、顺铂组、灵芝孢子提取物组和联合组的细胞克隆形成数目分别为(1698.49±213.32)个、(654.36±98.36)个、(642.32±59.69)个和(263.36±54.65)个。与H1299细胞组比较，顺铂组、灵芝孢子提取物组、联合组的细胞克隆形成数目明显降低(P<0.05)。与顺铂组和灵芝孢子提取物组比较，联合组的细胞克隆形成数目明显降低(P<0.05)。见图1。

图1 4组肺腺癌H1299细胞克隆形成数目(结晶紫染色 ×200)

A.H1299细胞组；B.顺铂组；C.灵芝孢子提取物组；D.联合组

2.3细胞凋亡率比较 H1299细胞组、顺铂组、灵芝孢子提取物组和联合组的细胞克隆形成数目分别为(0.84±0.54)%、(2.56±0.65)%、(2.34±0.63)%和(5.47±0.54)%。与H1299细胞组比较，顺铂组、灵芝孢子提取物组、联合组的细胞凋亡率明显升高(P<0.05)。与顺铂组和灵芝孢子提取物组比较，联合组的细胞凋亡率明显升高(P<0.05)。

2.4细胞侵袭迁移能力比较 与H1299细胞组比较，顺铂组、灵芝孢子提取物组、联合组的穿膜细胞数和迁移率明显降低(P<0.05)。与顺铂组和灵芝孢子提取物组比较，联合组穿膜细胞数和迁移率明显降低(P<0.05)。见表2、图2。

2.5TAZ mRNA和蛋白表达水平比较 与H1299细胞组比较，顺铂组、灵芝孢子提取物组、联合组TAZ mRNA和蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。与顺铂组和灵芝孢子提取物组比较，联合组TAZ mRNA和蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。见表3、图3。

表2 4组肺腺癌H1299细胞侵袭迁移能力的比较

注：与H1299细胞组比较，aP<0.05；与顺铂组比较，cP<0.05；与灵芝孢子提取物组比较，eP<0.05

图2 4组肺腺癌H1299细胞的穿膜细胞数(结晶紫染色 ×200)

A.H1299细胞组；B.顺铂组；C.灵芝孢子提取物组；D.联合组

表3 4组肺腺癌H1299细胞TAZ mRNA和蛋白表达水平比较

注：TAZ为具有PDZ结合域的转录共激活因子；与H1299细胞组比较，aP<0.05；与顺铂组比较，cP<0.05；与灵芝孢子提取物组比较，eP<0.05

图3 4组肺腺癌H1299细胞TAZ蛋白表达水平

A.H1299细胞组；B.顺铂组；C.灵芝孢子提取物组；D.联合组；TAZ为具有PDZ结合域的转录共激活因子

3 讨论

在晚期NSCLC患者中常单独使用铂类化疗或与其他药物联合使用作为第一线疗法，但对顺铂的耐药性仍然是主要的临床问题。目前，对顺铂耐药的机制尚不完全清楚，但研究认为其本质上是多因素的，包括DNA结合不足，解毒和DNA修复增加，转运蛋白表达失调，以及涉及细胞死亡途径的基因(例如p53、Bcl-2和AKT/mTOR)表达和活化改变。在上述途径中，AKT/mTOR途径的激活在顺铂耐药性中起重要作用。灵芝孢子提取物具有多种功能，如阻止组胺释放和抑制过度激活的免疫系统，并具有调节细胞和体液免疫的作用。灵芝孢子提取物具有多种有效成分，包括多糖、三萜、生物碱、酶和蛋白质[10]。有研究人员发现，来自灵芝的三萜类化合物抑制了脂多糖-刺激小鼠RAW264.7细胞分泌的肿瘤坏死因子-α、白介素-6、炎性一氧化氮和前列腺素E2。此外灵芝孢子提取物对肝癌、肺癌均有明显的抑制作用[11-12]。本研究结果发现，与H1299细胞组比较，顺铂组、灵芝孢子提取物组、联合组的OD值、存活率、细胞克隆形成数目、侵袭迁移能力均明显降低，凋亡率明显升高；与顺铂组和灵芝孢子提取物组比较，联合组的OD值、存活率、细胞克隆形成数目、侵袭迁移能力均明显降低，凋亡率明显升高。该结果与上述讨论一致，同时说明灵芝孢子提取物能明显抑制肺腺癌H1299细胞的增殖、侵袭，并促进其凋亡；而当灵芝孢子提取物与顺铂联合使用时，顺铂的抗肿瘤作用更强，这提示灵芝孢子提取物对肺腺癌H1299细胞顺铂化疗具有增敏作用。

越来越多的证据表明，TAZ是肺癌的致癌基因，对肺癌的发生和转移具有重要作用。临床肺癌研究报告显示，TAZ在60%以上的NSCLC中过表达，其表达与腺癌分化不良、转移、不良预后和生存密切相关[13]。此外，TAZ可增强口腔鳞状细胞癌、尿路上皮细胞癌和卵巢癌对顺铂的耐药性[14]。最近多项研究均表明，TAZ的上调可以增强对多种细胞毒性剂的抗性，如人乳腺癌细胞可通过TAZ-TEAD-Cyr61/CTGF信号通路对紫杉醇产生抗性；基因表达谱研究将TAZ鉴定为原发性乳腺癌干细胞系活化、致瘤、转移的中心介体[15-16]。顺铂耐药的口腔鳞癌细胞核TAZ表达量明显高于非顺铂耐药的口腔鳞癌细胞。此外，TAZ敲低还能通过增加DNA损伤和细胞凋亡使尿路上皮癌细胞对化疗和放射治疗的敏感性增加；TAZ信号可能通过增加细胞自噬通量来调节卵巢癌细胞中的顺铂耐药性[17-18]。本研究结果显示，与H1299细胞组比较，顺铂组、灵芝孢子提取物组、联合组的TAZ mRNA和蛋白表达明显降低，与顺铂组和灵芝孢子提取物组比较，联合组的TAZ mRNA和蛋白表达明显降低。这说明顺铂或灵芝孢子提取物单独作用时，均能明显抑制H1299细胞的TAZ mRNA和蛋白表达；而顺铂联合灵芝孢子提取物治疗对H1299细胞TAZ mRNA和蛋白表达的抑制更加强烈。提示灵芝孢子提取物能增强顺铂对H1299细胞TAZ mRNA和蛋白表达的抑制作用。

综上所述，灵芝孢子提取物对肺腺癌H1299细胞顺铂化疗具有增敏作用；其机制与灵芝孢子提取物能增强顺铂对H1299细胞TAZ mRNA和蛋白表达的抑制有关。