延胡索甲素调节NMDAR/NF-κB介导的信号通路对利血平诱导纤维肌痛大鼠的作用及机制研究

张振武，黄绍农，凌地洋，韩 健，吴呈祥

纤维肌痛又称纤维肌痛综合征，属于风湿病，是一种难治性局部疼痛综合征，以弥漫性压痛和疲劳为主要特征，同时对患者造成心理困扰，严重影响患者的生活质量。根据美国风湿病学会报道，全世界有2%～22%的人口出现纤维肌痛症状，其中女性患者居多[1-6]。纤维肌痛的病因复杂，目前在临床上尚没有系统的诊疗方案[7-8]。N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)是谷氨酸偶联离子通道，近年来有研究表明，NMDAR持续激活，进而导致神经元活化阈值降低、兴奋性增高和神经毒性，NMDAR主要由NR1和NR2亚基组成，而脑组织中分布的NMDAR主要为NR1和NR2B亚基[9-12]。核因子-κB(NF-κB)蛋白可以选择性地结合B细胞κ-轻链增强子上调控许多基因的表达，能够参与细胞对外界刺激的响应，NF-κB的错误调节会引发自身免疫病、慢性炎症以及多种癌症。近年来有研究表明，NF-κB/P65与纤维肌痛的发病机制密切相关[13-16]。延胡索甲素是从传统中药材延胡索的块茎中提取分离得到的一种化合物。目前相关研究均认为，延胡索甲素具有很好的镇痛作用，且其产生的中枢抑制等不良反应较小，使用安全方便[6-9]。但延胡索甲素对纤维肌痛的作用未见明确报道，本文通过研究延胡索甲素对利血平诱导纤维肌痛大鼠的作用及机制，为延胡索甲素在纤维肌痛中的临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1实验材料 选取SPF级健康雄性SD大鼠60只，6周龄，体重(180±20)g，购自长生生物技术有限公司，适应性饲养72 h，自由进食、饮水。延胡索甲素购自天津市永大化学试剂有限公司，NR1、NR2B、NF-κB/P65和GAPDH抗体均购自Proteintech公司，RIPA蛋白裂解液购自上海碧云天生物技术有限公司，ECL显色液购自Thermo公司，全自动生化分析仪购自北京岛津医疗器械有限公司，双垂直电泳仪、转印电泳仪、凝胶成像仪均购自伯乐生命医学产品有限公司、YLS-3E电子压痛仪购自北京吉安得尔科技有限公司。

1.2纤维肌痛大鼠模型的建立与分组 将大鼠随机分为对照组、模型组、延胡索甲素低、中、高剂量组，每组12只。模型组和延胡索甲素各剂量组根据大鼠体重皮下注射利血平1 mg/kg(以冰醋酸溶解，加入蒸馏水使醋酸终浓度为0.5%，现用现配)，连续3 d，每天1次[4]。对照组按照相同剂量皮下注射生理盐水。于末次给予利血平24 h后，对各组大鼠进行称重，记为初始体重，根据大鼠体重，对照组及模型组给予生理盐水20 ml/kg灌胃，延胡索甲素低、中、高剂量组分别给予5、10、20 mg/ml的延胡索甲素20 ml/kg灌胃，所有组别每天定时给药1次，连续给药10 d，最后一次给药24 h后，再次对大鼠进行称重，记为最终体重，计算大鼠体重减轻值，体重减轻值=初始体重-最终体重。

1.3机械性痛阈值的测定 采用YLS-3E电子压痛仪，将大鼠放置于透明固定器内适应10 min。分别将大鼠左、右爪放在电子压痛仪压头下，于2、3跖骨间施加压力，大鼠缩爪或是发出尖叫声，停止加压，记录其压力值。每只动物测定3次，每次间隔30 s，取3次左右爪压力值的平均值记为机械性痛阈值。最大压力值设置为300 g，防止损伤鼠爪。

1.4大鼠血浆炎性因子水平的测定 所有大鼠最后一次给药24 h后，通过眼眶后静脉丛取血至肝素润洗过的离心管中，室温静置5 min，然后在4℃条件下，置于离心机以3500 r/min离心10 min。取上清液进样至全自动生化分析仪，检测血浆肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)及IL-1β水平。

1.5大鼠脑组织含水量检测 每组取6只大鼠，颈椎脱臼处死后迅速分离大鼠脑组织，用生理盐水清洗，除去血液，用滤纸吸干表面水分后称重，记为湿重，然后置于110℃恒温干燥箱内干燥24 h至恒重，称重记为干重，计算各组大鼠脑组织含水量，脑组织含水量=(湿重-干重)/湿重×100%。

1.6组织样本采集与蛋白提取 每组取6只大鼠，颈椎脱臼处死后迅速分离大鼠脑组织，用生理盐水清洗，除去血液，用滤纸吸干表面水分后，将一部分脑组织放入10%中性甲醛中固定，其余部分放入玻璃匀浆器中，加入RIPA蛋白裂解液，用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解，在4℃条件下，置于离心机以12000 r/min离心10 min，用移液枪将上清液移至另一干净离心管中，并加入SDS loading buffer，混匀后放入100℃水浴5 min，然后放入-20℃储存备用。

1.7HE染色 将10%中性甲醛固定24 h的大鼠脑组织转移至75%乙醇中，经自动组织脱水机脱水、透明处理，在石蜡包埋机中浸蜡、包埋，进行5 μm切片，水浴展开、捞片、沥干，放入45℃恒温箱中烘干，置于烘箱中60℃烤2 h，常规HE染色，在显微镜下进行组织病理学观察。

1.8Western blot检测 将冻存的大鼠脑组织蛋白液于室温下融化后，采用BCA法测定蛋白浓度，取50 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳分离、转膜，将分离的蛋白电转移至PVDF膜上。封闭液室温封闭1 h，加入抗体NR1、NR2B及NF-κB/P65(均1∶1000)，4℃孵育过夜。PBST充分洗膜后，加入二抗(1∶2000)室温孵育1 h，PBST清洗后显色液显影，凝胶成像仪成像后，应用Image J软件进行免疫印迹灰度值检测，Graphpad prism 5进行作图。

2 结果

2.1延胡索甲素对纤维肌痛大鼠痛阈值的影响 对照组、模型组、延胡索甲素低、中、高剂量组痛阈值分别为(106.83±2.86)g、(74.19±2.13)g、(82.11±2.89)g、(91.36±2.25)g、(108.47±2.67)g。与对照组比较，模型组痛阈值显著下降(P<0.05)，提示造模成功。与模型组比较，延胡索甲素低、中、高剂量组痛阈值显著升高(P<0.05)。同时，随着延胡索甲素剂量的增加，纤维肌痛大鼠的痛阈值也逐渐升高(P<0.05)，表现出剂量依赖性。

2.2延胡索甲素对纤维肌痛大鼠血浆炎性因子水平的影响 与对照组比较，模型组血浆TNF-α、IL-6及IL-1β水平显著升高(P<0.05)。与模型组比较，延胡索甲素低、中、高剂量组血浆TNF-α、IL-6、IL-1β水平显著下降(P<0.05)。同时，随着延胡索甲素剂量的增加，纤维肌痛大鼠血浆TNF-α、IL-6、IL-1β水平也逐渐降低(P<0.05)，表现出剂量依赖性。见表1。

表1 5组大鼠血浆TNF-α、IL-6、IL-1β水平比较

注：TNF-α为肿瘤坏死因子-α，IL-6为白介素-6，IL-1β为白介素-1β；与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，cP<0.05；与延胡索甲素低剂量组比较，eP<0.05；与延胡索甲素中剂量组比较，gP<0.05

2.3延胡索甲素对纤维肌痛大鼠脑组织含水量和体重减轻值的影响 与对照组比较，模型组的脑组织含水量和体重减轻值均显著升高(P<0.05)。提示纤维肌痛大鼠脑组织存在炎性水肿，并影响其饮食状态，导致体重下降明显。与模型组比较，延胡索甲素低、中、高剂量组的脑组织含水量和体重减轻值均显著降低(P<0.05)。同时，随着延胡索甲素剂量的增加，纤维肌痛大鼠的脑组织含水量和体重减轻值逐渐降低(P<0.05)，表现出剂量依赖性。见表2。

表2 5组大鼠脑组织含水量和体重减轻值比较

注：与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，cP<0.05；与延胡索甲素低剂量组比较，eP<0.05；与延胡索甲素中剂量组比较，gP<0.05

2.4纤维肌痛大鼠脑组织病理学检查结果 与对照组比较，模型组脑组织细胞间隙增大，细胞肿胀，细胞核缩小、破裂，核仁不明显；与模型组比较，延胡索甲素高、中、低剂量组脑组织细胞破裂凋亡减少，细胞核完整，核仁清晰可见，细胞形态圆润，细胞间隙缩小。见图1。

图1 5组大鼠脑组织病理学检查结果(HE ×400)

A.对照组；B.模型组；C.延胡索甲素低剂量组；D.延胡索甲素中剂量组；E.延胡索甲素高剂量组

2.5延胡索甲素对纤维肌痛大鼠脑组织NR1、NR2B、NF-κB表达的影响 与对照组比较，模型组脑组织NR1、NR2B、NF-κB/P65表达水平显著升高(P<0.05)。与模型组比较，延胡索甲素高、中、低剂量组脑组织NR1、NR2B、NF-κB/P65表达水平显著降低(P<0.05)，表现出剂量依赖性。见图2。

图2 5组大鼠脑组织NR1、NR2B、NF-κB/P65表达水平

A.对照组；B.模型组；C.延胡索甲素低剂量组；D.延胡索甲素中剂量组；E.延胡索甲素高剂量组；NF-κB为核因子-κB；与对照组比较：aP<0.05；与模型组比较：cP<0.05

3 讨论

纤维肌痛是一种难治性局部疼痛综合征，以弥漫性压痛和疲劳为主要特征，同时伴有多种全身症状，包括僵硬、认知障碍、失眠、抑郁、焦虑、感觉不适、关节僵硬和胃肠道反应等，严重影响患者的生活质量[6]。纤维肌痛的病因复杂，主要包括遗传易感性、外界刺激、身体创伤、年龄、性别和心理因素。目前，在临床上治疗纤维肌痛主要使用抗抑郁药、止痛药等进行对症处理，尚没有系统的诊疗方案[7-8]。

NMDAR持续激活能够导致神经元活化阈值降低、兴奋性增高以及神经毒性。还在神经系统发育和神经元回路形成过程中发挥着重要的生理作用。NF-κB蛋白可以选择性地结合B细胞κ-轻链增强子上调控许多基因的表达。在细胞的炎症反应、免疫应答等过程中NF-κB起到关键性作用。NF-κB的错误调节会引发自身免疫病、慢性炎症以及很多癌症。NF-κB也与突触的可塑性、记忆有关。哺乳动物中NF-κB家族有5种蛋白，分别为：P65、RelB、c-Rel、P50和P52，而NF-κB/P65在纤维肌痛的发病过程中起到重要的作用[13-16]。

延胡索甲素是从罂粟科植物延胡索的块茎中提取分离得到一种重要有效成分，在临床上具有很好的镇痛作用，作用弱于乙素及丑素，但其产生的不良反应也较小，临床应用安全性较高。目前，延胡索甲素治疗纤维肌痛的效果及作用机制研究较为少见，本文通过研究延胡索甲素对利血平诱导的纤维肌痛大鼠的作用及机制，为延胡索甲素在纤维肌痛中的临床应用提供依据。

本文通过连续10 d给予纤维肌痛大鼠模型不同剂量的延胡索甲素灌胃后发现，与对照组比较，模型组痛阈值显著下降；与模型组比较，延胡索甲素低、中、高剂量组痛阈值呈剂量依赖性显著升高。提示本实验纤维肌痛大鼠造模成功，且延胡索甲素能够呈剂量依赖性的显著升纤维肌痛大鼠的痛阈值，改善其病理状态。本研究结果发现，与对照组比较，模型组血浆TNF-α、IL-6及IL-1β水平显著升高；与模型组比较，延胡索甲素低、中、高剂量组血浆TNF-α、IL-6、IL-1β水平呈剂量依赖性显著下降。提示延胡索甲素能够呈剂量依赖性的降低纤维肌痛大鼠血浆TNF-α、IL-6、IL-1β水平，抑制其体内炎性因子的释放，改善炎症状态，缓解疾病进展。本研究结果还发现，与对照组比较，模型组脑组织含水量及体重减轻值均显著升高；与模型组比较，延胡索甲素低、中、高剂量组脑组织含水量及体重减轻值均呈剂量依赖性显著降低。提示延胡索甲素能够呈剂量依赖性的减轻纤维肌痛大鼠的脑组织水肿，提高其生存质量，还能明显改善纤维肌痛大鼠的饮食及生理状态，改善疾病转归。各组大鼠脑组织病理学检查结果表明，与对照组比较，模型组大鼠脑组织细胞间隙增大，细胞肿胀，细胞核缩小、破裂，核仁不明显；提示利血平诱导的纤维肌痛大鼠脑组织发生明显病理性改变。与模型组比较，延胡索甲素低、中、高剂量组脑组织细胞破裂死亡减少，细胞核完整，核仁清晰可见，细胞形态圆润，细胞间隙缩小；提示延胡索甲素能够改善纤维肌痛大鼠脑组织病理状态，缓解疾病进展。Western blot检测结果表明，与对照组比较，模型组脑组织NR1、NR2B、NF-κB/P65表达水平显著升高；提示纤维肌痛大鼠脑组织NR1、NR2B、NF-κB/P65的表达水平可能与纤维肌痛发病机制密切相关。与模型组比较，延胡索甲素高、中、低剂量组脑组织NR1、NR2B、NF-κB/P65表达水平均呈剂量依赖性显著降低。提示延胡索甲素能够呈剂量依赖性的显著降低纤维肌痛大鼠脑组织NR1、NR2B、NF-κB/P65表达水平，从而抑制疼痛信号的传导，抑制疾病的进展，缓解病理状态，改善疾病转归。

综上所述，延胡索甲素能够改善利血平诱导纤维肌痛大鼠的疾病状态，其机制可能与调节NMDAR/NF-κB介导的信号通路有关。