复合预混合饲料中β-胡萝卜素测定方法研究

施杏芬，吕伟军，陈 凯，阮 鑫

（浙江省兽药饲料监察所，浙江杭州 311199）

β-胡萝卜素是一种重要的营养性添加剂和天然色素，不仅具有维生素A 的生物活性，而且在增强免疫及抗氧化等方面都有显著的功效，广泛应用于食品和动物养殖中。在畜禽养殖中添加β-胡萝卜素可增强动物的免疫能力，提高成活率，并且可改善动物产品的色泽，从而提高其产品的附加值。农业部2625 号公告《饲料添加剂安全使用规范》中规定β-胡萝卜素作为维生素类添加剂，可以在养殖动物中添加使用，但其作为着色剂只允许在家禽中按生产需要适量使用。化学合成着色剂毒性 ADI 0～0.03 （FAO／WHO，2001），半致死量 （LD50）＞10 g/kg (小鼠，经口）（顾君华，2007）。目前，还没有一种饲料中β-胡萝卜素的测定方法。因此，为从源头控制畜产品质量安全，监控复合预混合饲料中β-胡萝卜素的添加水平，建立相应的分析测定方法具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 仪器、 试剂和材料 Aglient 1260 高效液相色谱仪，紫外检测器；分析天平，梅特勒；超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；旋转蒸发仪，BUCHI 公司；旋涡仪，TALBYSTM。

全反式β-胡萝卜素标准品，纯度≥95%，北京曼哈格生物科技有限公司；甲醇、色谱纯，赛默飞世尔科技有限公司；异丙醇、色谱纯，默克股份有限公司；二氯甲烷、色谱纯，天地股份有限公司；石油醚（沸程 30～60 ℃）、无水硫酸钠、无水乙醇、氢氧化钾、氯化钠，分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司；乙二胺四乙酸二钠（EDTA）、2,6-二叔丁基对甲酚（BHT）、L-抗坏血酸，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；娃哈哈超纯水；尼龙针式过滤器 WAT200520（0.45 μm）。

1.2 标准溶液的配制 称取全反式β-胡萝卜素标准品50 mg 至100 mL 棕色容量瓶中，加入10 mL二氯甲烷溶解并定容 （GB 5009.83-2016），配成500 μg/mL 的标准储备液，-20 ℃保存。稀释配成0.00、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00 μg/mL 系列标准溶液。

1.3 HPLC 分析条件 色谱柱：Aglient SB-C18柱，长 250 mm，内径 4.6 mm，粒径 5 μm；流速：1.5 mL/min；检测波长：450 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 μL；流动相：甲醇+异丙醇+二氯甲烷=80+17+3（V/V/V）。

1.4 样品处理 称取1 g 复合预混合饲料于已加入1 g EDTA 的三角瓶中，加入50 mL L-抗坏血酸乙醇溶液，加入10 mL 氢氧化钾溶液，于50 ℃水浴超声20 min。将该溶液转移至盛有80 mL 石油醚的分液漏斗中，用水洗三角瓶并入分液漏斗。水相转移至另一分液漏斗中，用50 mL 石油醚重复提取两次。用100 mL 饱和氯化钠溶液洗涤提取液，并用水洗涤提取液至中性，过无水硫酸钠，转移至放有几粒BHT 的棕色容量瓶中，用石油醚定容。分取一定体积于旋转蒸发器烧瓶，减压浓缩至近干，用流动相溶解，旋涡混匀。过 0.45 μm 滤膜，供高效液相色谱仪测定。

2 结果与分析

2.1 分析图谱 β-胡萝卜素标准溶液色谱图见图1，空白复合预混合饲料色谱图见图2，添加β-胡萝卜素的复合预混合饲料色谱图见图3。

图1 标准图谱

图2 空白样品

图3 加标样品

2.2 标准曲线 以峰面积为纵坐标，相应标准系列溶液为横坐标绘制标准曲线，结果显示β-胡萝卜素浓度与其对应的峰面积呈良好的线性关系。线性回归方程、相关系数见表1。

表1 标准曲线的回归方程与相关系数

2.3 准确度和精密度 在空白的复合预混合饲料中分别添加 β-胡萝卜素 2、752、1500 mg/kg三个浓度，每个浓度6 个重复，平均回收率为95%～102%，批内 RSD 小于 6%，批间 RSD 小于 4%（表2）。

表2 复合预混合饲料中β-胡萝卜素的回收率测定结果

2.4 检测限和定量限 用本研究方法测定复合预混合饲料中β-胡萝卜素含量，其检测限按S/N≥3，为 1 mg/kg；定量限按 S/N≥10，为 2 mg/kg，由表2 可见，添加浓度为2 mg/kg 时，其平均回收率为101.7%，批内RSD 为5.37%，说明该方法检测性能较好。

3 讨论

3.1 色谱柱的选择 选用不同品牌的C8、C18 色谱柱，按照食品安全国家标准 食品中胡萝卜素的测定（GB 5009.83-2016）中的色谱条件二测定，大部分色谱峰都有拖尾，只有Aglient ZORBA SB C18 色谱峰对称较好，几乎没有拖尾。因此确定Aglient ZORBA SB-C18 柱作为β-胡萝卜素的检测色谱柱。

3.2 流动相的选择 由于β-胡萝卜素可溶于丙酮、三氯甲烷、石油醚等，难溶于甲醇和乙醇。通过比较甲醇+乙腈+三氯甲烷=85+12+3(GB 5009.83-2016)、甲醇+乙腈+三氯甲烷=85+12+3（1000 mL中1.0 mL 三氟乙酸）、甲醇+异丙醇=82+18、甲醇+异丙醇=85+15、甲醇+异丙醇+二氯甲烷=80+17+3几组流动相，只有甲醇+异丙醇+二氯甲烷=80+17+3 的流动相色谱峰比较对称和尖锐，因此，选择甲醇+异丙醇+二氯甲烷作为研究的流动相。

3.3 提取试剂的选择 由于β-胡萝卜素对光、热、氧不稳定，不耐酸，弱碱性时较稳定，用碱液皂化后，分别用环己烷、氯仿、石油醚等溶液提取，发现石油醚萃取时回收率比较稳定，故选用石油醚作为萃取液。

3.4 实际样品检测 对添加400 mg/kg β-胡萝卜素的复合预混合饲料进行检测，测定结果为391 mg/kg。

4 结论

β-胡萝卜素是类胡萝卜素的一种，属于脂溶性化合物，直接提取回收率不高，故本试验采用碱液皂化，石油醚萃取，建立了复合预混合饲料中β-胡萝卜素的测定高效液相色谱法，结果表明复合预混合饲料中添加β-胡萝卜素浓度为2～1500 mg/kg 时，其回收率均在 95%以上，RSD 小于6%。该方法稳定性好，分离度高，具有较好的准确度和精密度，可以满足日常的检测需求。