不同干燥方法对金银花叶主要成分的影响

姜 珊，马青琳，张康华，张 芳，代 龙，高 鹏

（山东中医药大学药学院，山东济南 250300）

金银花（Lonicera japonica Thunb.）主要含有木犀草苷、忍冬苷等黄酮类成分，绿原酸、异绿原酸等酚酸类成分和以马钱苷为代表的环烯醚萜苷类成分（刘婵娟等，2010）。研究表明金银花具有抗病原微生物、抗氧化、解热消炎、抗病毒、降血糖（刘敬盛等，2016；潘秋文等，2004）等药理作用。近年来金银花作为药源需求量日益增加（董熙嘏等，1984）。它的副产品金银花叶为忍冬的干燥叶，本品产量很高，但其被认为是非药用部分，并且长期未被利用（武雪芬等，2001）。不同历史时期忍冬药用部位各异，在梁代时期药用部位为茎和叶（朱姮等，2016） 。武雪芬（1997）研究表明，金银花越冬老叶中黄酮含量分别为金银花的2.78 倍、 藤的6.98 倍。山东和河南等地区金银花叶片的绿原酸含量和金银花相当。华金6 号金银花是山东中医药大学经过10 余年培育出的金银花新品种。该品种金银花叶资源丰富，成本较低，可作为饲料添加剂，具有很高的开发价值。

研究表明，干燥方法会影响药材的品质。金银花叶不同干燥方式对绿原酸、马钱苷、木犀草苷、总酚酸、 总黄酮和总环烯醚萜苷成分含量的影响鲜见报道。本试验考察阴干法，真空干燥法、烘干40、50、60、70、80、100 ℃条件下，金银花叶主要成分的含量变化，以期为金银花叶的开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 高效液相色谱仪（岛津LC-2030，自动进样，UVD 检测器），COSMOSIL 5C18-MS-II色谱柱 （4.6×250 mm，5 μm），Welch Ultimate XBPhenyl （4.6×250 mm，5 μm），紫外-可见光光度仪（上海仪电分析仪器厂，L3S），超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司 ，KQ-250），高速粉碎机（上海兆申科技有限公司，XS-02），电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司，AL-204），移液枪（Dragon-Lab），真空干燥箱 （上海精宏试验设备厂，DZF-6051），电热鼓风干燥箱（林茂科技，101 型）。

绿原酸标准品 （中检院，批号 110753-201716），马 钱苷 对 照品 （中 检 院 ，111640-201606），木犀草苷对照品（中检院，批号111720-201609），甲醇（色谱纯），乙醇（分析纯），乙腈（色谱纯），冰乙酸（色谱纯），磷酸（色谱纯），娃哈哈纯净水。

1.2 金银花叶采集 2018 年6 月于山东中医药大学药用植物园采集金银花枝条中部叶片，样品经山东中医药大学鉴定为华金六号金银花叶。取适量金银花叶经干燥粉碎后，于索氏提取器中回流至石油醚无色，金银花叶粉末挥干石油醚后备用。

1.3 干燥方法 将华金六号金银花鲜叶分为8组，每组约150 g，按表1 条件进行干燥。

表1 金银花叶干燥方式及条件

1.4 指标成分含量测定

1.4.1 绿原酸含量测定 对照品溶液的制备：取适量绿原酸对照品，精密称定，置于棕色量瓶中，加50%甲醇制成0.04 mg/mL 的溶液，10 ℃以下保存（中国药典，2015）。

供试品溶液的制备：取约0.5 g 金银花叶粉末（过四号筛），精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，称定重量，超声处理 （功率250 W，频率 35 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5 mL，置25 mL 棕色量瓶中，加入50%甲醇至刻度，摇匀，即得。

色谱条件：使用C18 柱；以乙腈-0.4%磷酸溶液（13 : 87）为流动相。检测波长为 327 nm，流速1 mL/min，柱温 30 ℃。色谱图见图1。

1.4.2 木犀草苷含量测定 对照品溶液的制备：取木犀草苷对照品适量，精密称定，加70%乙醇制成 0.04 mg/mL 的溶液，即得（中国药典，2015）。

图1 绿原酸对照品（A）和绿原酸供试品（B）HPLC 色谱图

供试品溶液的制备：取约2 g 金银花叶粉末（过四号筛），精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，称定重量，超声处理（功率250 W，频率 35 kHz）1 h，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液10 mL，回收溶剂至干，残渣用70%乙醇溶解，转移至5 mL 量瓶中，加70%乙醇至刻度，即得。

色谱条件：使用苯基硅烷键合硅胶色谱柱；以乙腈作为流动相A 和0.5%冰醋酸溶液作为流动相B 进行梯度洗脱；检测波长为350 nm。流速1 mL/min，柱温 30 ℃。色谱图见图2。

图2 木犀草苷对照品（A）和木犀草苷供试品（B）HPLC 色谱图

1.4.3 马钱苷含量测定 对照品溶液的制备：取适量马钱苷对照品，精密称定，加50%甲醇制成每 0.04 mg/mL 的溶液，即得（中国药典，2015）。

供试品溶液的制备： 取约1 g 金银花叶粉末（过三号筛），精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，称定重量，超声处理 （功率500 W，频率 40 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液即得。

色谱条件： 使用苯基硅烷键合硅胶色谱柱；以乙腈-0.4%磷酸溶液（12:88）为流动相。检测波长为 236 nm，流速 1 mL/min，柱温 25 ℃。色谱图见图3。

图3 马钱苷对照品（A）和马钱苷供试品（B）HPLC 色谱图

1.4.4 总黄酮含量测定 对照品溶液的制备：精密称取木犀草苷对照品适量，加60%乙醇溶解并配制成约0.2 mg/mL 的溶液，即得。

供试品溶液的制备：金银花叶经干燥粉碎后，精密称取约1 g 粉末（过三号筛），置于具塞锥形瓶后精密加入25 倍量60%乙醇，超声处理（功率500 W，频率 40 kHz）50 min，用 60%的乙醇补足减失的重量，放冷至室温，抽滤后将滤液置于100 mL 容量瓶中，用60%乙醇稀释至刻度，即得。

含量测定：参照李志明等（2006）总黄酮含量测定方法并稍作修改。分别取阴干金银花叶醇提液0.5 mL、 真空60 ℃烘干金银花叶醇提液0.5 mL、40 ℃烘干金银花叶醇提液 0.4 mL、50 ℃烘干金银花叶醇提液0.5 mL、60 ℃烘干金银花叶醇提液 1 mL、70 ℃烘干金银花叶醇提液 0.9 mL、80℃烘干金银花叶醇提液1 mL、100 ℃烘干金银花叶醇提液0.8 mL 于25 mL 容量瓶中，用60%乙醇定容至刻度，于350 nm 测吸光度，计算总黄酮浓度。

1.4.5 总酚酸含量测定 对照品溶液的制备：精密称取绿原酸标准品适量，加70%乙醇溶解并配制成约0.2 mg/mL 的溶液，即得。

供试品溶液的制备：金银花叶经干燥粉碎后，精密称取约1 g 粉末（过三号筛），置于具塞锥形瓶后精密加入25 倍量70%乙醇，超声处理（功率500 W，频率 40 kHz）30 min，用 70%的乙醇补足减失的重量，放冷至室温，抽滤后将滤液置于100 mL 容量瓶中，用70%乙醇稀释至刻度，即得。

含量测定：参照宋琳琳等（2013）总酚酸含量测定方法并稍作修改。分别取阴干金银花叶醇提液0.4 mL、真空60 ℃烘干金银花叶醇提液0.5 mL、40 ℃烘干金银花叶醇提液0.3 mL、50 ℃烘干金银花叶醇提液0.5 mL、60 ℃烘干金银花叶醇提液0.8 mL、70 ℃烘干金银花叶醇提液 0.8 mL、80 ℃烘干金银花叶醇提液1 mL、100 ℃烘干金银花叶醇提液0.8 mL 于25 mL 容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度，于327 nm 测吸光度，计算总酚酸浓度。

1.4.6 总环烯醚萜苷含量测定 对照品溶液的制备：精密称取马钱苷对照品适量，加90%乙醇溶解并配制成约0.2 mg/mL 的溶液，即得。

供试品溶液的制备：金银花叶经干燥粉碎后，精密称取约1 g 粉末（过三号筛），置于具塞锥形瓶后精密加入15 倍量90%乙醇，超声处理（功率500 W，频率 40 kHz）30 min，用 90%的乙醇补足减失的重量，放冷至室温，抽滤后将滤液置于100 mL 容量瓶中，用90%乙醇稀释至刻度，即得。

含量测定：参照王赟等（2011）总环烯醚萜苷含量测定方法并稍作修改。分别取阴干金银花叶醇提液0.5 mL、 真空60 ℃烘干金银花叶醇提液0.5 mL、40 ℃烘干金银花叶醇提液 0.4 mL、50 ℃烘干金银花叶醇提液0.5 mL、60 ℃烘干金银花叶醇提液0.8 mL、70 ℃烘干金银花叶醇提液0.5 mL、80 ℃烘干金银花叶醇提液0.5 mL、100 ℃烘干金银花叶醇提液0.5 mL 于25 mL 容量瓶中，用90%乙醇定容至刻度，于236 nm 测吸光度，计算总环烯醚萜苷浓度。

1.5 各指标成分方法学考察

1.5.1 绿原酸、马钱苷、木犀草苷含量测定方法学考察

1.5.1.1 标准曲线的绘制 分别取绿原酸、 马钱苷、木犀草苷对照品，按各成分色谱条件注入色谱仪，以峰面积为纵坐标，对照品浓度为横坐标进行回归分析，见表2。

1.5.1.2 精密度试验 分别取 “2.3.1”、“2.3.2”、“2.3.3”中制备的供试品溶液，按各指标成分色谱条件，连续进样6 次，记录峰面积，绿原酸、马钱苷、木犀草苷含量的RSD 值见表3，结果表明方法精密度良好。

表2 线性关系考察

1.5.1.3 稳定性试验 分别取“2.3.1”“2.3.2”“2.3.3”中制备的供试品溶液，按各指标成分色谱条件，分别于 2、4、6、8、12、24 h 进样，记录峰面积，绿原酸、马钱苷、木犀草苷含量的RSD 值见表3。

1.5.1.4 重复性试验 分别取6 份金银花叶供试品溶液，按各指标成分色谱条件，进样后绿原酸、马钱苷、木犀草苷峰面积的RSD 值见表3，表明重复性良好。

1.5.1.5 加样回收率试验 分别取已测定指标成分量的金银花叶样品溶液6 份，精密称定，加入对照 品 0.0412 mg/mL 绿 原 酸 、0.0388 mg/mL 马 钱苷、0.04164 mg/mL 木犀草苷各0.4 mL，按照各指标成分色谱条件进样测定。计算得绿原酸、 马钱苷、 木犀草苷平均回收率分别为 99.61%、100.05%、 99.78%，RSD 值见表3。

1.5.2 总黄酮、总酚酸、总环烯醚苷含量测定方法学考察

1.5.2.1 标准曲线的绘制 分别取绿原酸、 马钱苷、木犀草苷对照品，在 327、236、350 nm 下测定吸光度，以吸光度为纵坐标，对照品浓度为横坐标进行回归分析，见表2。

1.5.2.2 精密度试验 分别取 “2.3.4”、“2.3.5”、“2.3.6”中制备的供试品溶液，在 350、327、236 nm下测定总黄酮、总酚酸、总环烯醚萜苷的吸光度，连续测定 6 次，RSD 值见表3。

1.5.2.3 稳定性试验 分别取 “2.3.4”、“2.3.5”、“2.3.6”中制备的供试品溶液，在 350、327、236 nm下分别测定总黄酮、总酚酸、总环烯醚萜苷2、4、6、8、12、24 h 后供试品溶液的吸光度，RSD 值见表3。

1.5.2.4 重复性试验 取金银花叶供试品溶液6份，分别在 350、327、236 nm 下测定总黄酮、 总酚酸、总环烯醚萜苷吸光度，RSD 值见表3。

1.5.2.5 加样回收率试验 分别取已测定指标成分量的金银花叶样品溶液6 份，加入0.1816 mg/mL木犀草苷对照品0.4 mL、0.1936 mg/mL 绿原酸对照品 0.2 mL、0.1928 mg/mL 马钱苷对照品0.5 mL，分别在 350、327、236 nm 下测定总黄酮、总酚酸、总环烯醚萜苷吸光度，计算的平均回收率分别为98.76%、99.06%、101.1%。RSD 值见表3。

表3 指标成分方法学考察RSD 值 %

1.6 数据分析 采用Graphpad Prism 绘制相应的图表，IBM SPSS Statistics 21 分别对绿原酸、马钱苷、木犀草苷、总酚酸、总黄酮、总环烯醚萜苷进行单因素方差分析和多重比较，Microsoft excel 2016 对数据进行处理。

2 试验结果

2.1 干燥方法对金银花叶失水率及外观的影响从表4 可以看出，不同烘干温度对金银花叶外观存在影响，温度越高，金银花叶颜色越深。

表4 不同干燥方法金银花叶失水率及外观颜色

2.2 绿原酸、马钱苷和木犀草苷的含量测定结果由图4 可知，金银花叶中绿原酸、马钱苷和木犀草苷的含量因不同干燥方式而存在显著差异。绿原酸含量在40 ℃烘干时最高，为40.9692 mg/g。在阴干和100 ℃烘干条件下，绿原酸含量无显著性差异。真空 60 ℃和 50、60、80、70 ℃烘干条件下绿原酸含量存在显著性差异，其中70 ℃烘干处理时绿原酸含量最低。马钱苷含量以40 ℃烘干含量最高，为35.3032 mg/g。八种不同干燥方式下马钱苷含量存在显著性差异，马钱苷含量由高到低排序为 40 ℃烘干＞真空 60 ℃烘干＞50 ℃烘干＞100 ℃烘干＞阴干＞60 ℃烘干＞80 ℃烘干＞70 ℃烘干。木犀草苷在阴干条件下含量最高，为15.4562 mg/g。真空60 ℃烘干、80 ℃烘干和100 ℃烘干干燥方式对木犀草苷含量无显著影响且木犀草苷含量最低。八种不同干燥方式下，绿原酸、马钱苷含量总体趋势一致，从阴干、 真空60 ℃烘干到40 ℃烘干，含量逐步上升。50、60、70 ℃烘干时绿原酸和马钱苷含量呈现递减趋势，且在70 ℃烘干时含量达到最低水平，随着温度的升高，在80 ℃烘干和100 ℃烘干条件下，两者含量逐步增加。木犀草苷含量在70 ℃烘干条件下最低，为0.9554 mg/g，在80 ℃烘干和100 ℃烘干时呈现增长趋势。

图4 绿原酸、马钱苷、木犀草苷含量测定

2.3 总酚酸、总黄酮、总环烯醚萜苷含量测定结果 结果见图5，不同干燥方式对金银花叶总酚酸、总黄酮和总环烯醚萜苷的含量影响显著。总酚酸含量以40 ℃烘干时最高，其次为阴干，二者无显著性差异，其含量在60 ℃烘干时最低，为18.5333 mg/g，与70 ℃烘干无显著性差异。总黄酮含量以40 ℃烘干最高，为54.0721 mg/g，其次为阴干法，二者无显著性差异，60 ℃烘干时总黄酮含量最低。总环烯醚萜苷含量因烘干方法不同明显分为四组，四组间差异显著。其含量以阴干和40 ℃烘干最高，二者无显著性差异。其次为真空60 ℃烘干，50 ℃烘干和 100 ℃烘干，三者之间无显著性差异。70 ℃烘干和80 ℃烘干时总环烯醚萜苷含量最低，二者之间无显著性差异，分别为54.7235 mg/g 和 56.2156 mg/g。

图5 总酚酸、总黄酮、总环烯醚萜含量测定

3 分析与讨论

叶绿素主要有 2 种，叶绿素 a 在 645 nm 和663 nm 处均有吸收，在645 nm 处吸光系数较小；叶绿素b 在645 nm 和663 nm 处亦都有吸收，但在645 nm 处吸光系数较大，在663 nm 处较小。本试验总黄酮、 总酚酸和总环烯醚萜苷含量测定所用吸光度分别为350、327 nm 和236 nm，处于叶绿素吸收曲线波谷位置，且样品经25 倍稀释，影响甚微。本试验前期预试验取金银花叶经干燥粉碎后，精密称取约1 g 粉末（过三号药典筛），于索氏提取器中回流至石油醚无色，后置于具塞锥形瓶后精密加入25 倍量70%乙醇，超声处理（功率 500 W，频率 40 kHz）30 min，用 70%的乙醇补足减失的重量，放冷至室温，抽滤后将滤液置于100 mL 容量瓶中，用70%乙醇稀释至刻度。后取1 mL 提取液于25 mL 棕色容量瓶中，用70%乙醇稀释至刻度。取未脱色金银花叶粉末按上述条件进行制备提取液后稀释相同倍数。测石油醚脱色后和未脱色总酚酸吸光度分别为0.361 和0.362相差不大，可以接受，故用醇提液直接测总成分含量。参考宋琳琳等（2013）和罗海青等（2018）报道方法，紫外分光光度法测定苍耳草总酚酸和黄皮叶总黄酮含量中，经50%甲醇提取液和70%乙醇提取液后用比色法在波长326 nm 和503 nm 处测定总酚酸和总黄酮含量，也不涉及脱去醇溶性叶绿素的步骤。可见醇溶性叶绿素对试验结果的影响可忽略不计。

总酚酸、 总黄酮和总环烯醚萜苷的含量用紫外分光光度计法分别以绿原酸、 木犀草苷和马钱苷为对照品于 327、350 nm 和 236 nm 处测定。李志明等（2006）测得金银花和叶总黄酮样品提取液最大吸收位置为363 nm 左右。本课题组对金银花叶总黄酮提取液进行全波长扫描测定，金银花叶总黄酮提取液最大吸收波长在355 nm左右，因木犀草苷在350 nm 处有最大吸收，故本试验以木犀草苷为对照品于350 nm 测定总黄酮样品提取液的吸光度，进而测得总黄酮含量。宋琳琳等（2013）和王赟等（2011）研究表明，总酚酸提取液在326 nm 处、总环烯醚萜苷提取液在238 nm 处有最大吸收。绿原酸和马钱苷最大吸收波长分别为327 nm 和236 nm，故本试验分别以绿原酸和马钱苷为对照品于327 nm 和236 nm 处测定总酚酸和总环烯醚萜苷样品提取液的吸光度，进而测定含量。

通常认为，金银花叶颜色越深，其有效成分含量越低。但是本试验测得在80 ℃烘干和100℃烘干时，金银花叶中大多数有效成分含量反而呈现递增趋势，与张永清等（1999）得出的干燥后药材外观色泽深浅与其绿原酸含量呈负相关，即药材色泽越深，绿原酸含量越低的结论有差异。此外，不同厚度下干燥金银花叶对其外观性状及有效成分含量也有影响。较薄时金银花叶干燥过度，导致色泽发黑、蜷缩严重，金银花外观形状较差同时单层物料内的氧化酶对温度变化敏感，易被激活，从而使多种有效成分含量降低而影响金银花叶质量。金银花叶太厚时，干燥不均匀，水分含量较高且干燥程度不均匀，干燥时间过长导致金银花叶颜色变深，影响金银花叶品质（赵桂明，2013）。

绿原酸含量的高低是金银花质量好坏的标准，也是干燥后成品检验的一个重要指标（吉永奇等，2008）。绿原酸属于植物体内的次生代谢产物，其极易在多酚氧化酶的作用下氧化缩合成高分子的有色物质发生褐变 （张永清等，1998）。当温度低于氧化酶的变性温度时，温度越高，多酚氧化酶的活性越高，绿原酸由于酶的作用含量逐步减少。当温度过高使酶失去活性，绿原酸氧化缩合作用减少，含量呈现上升趋势（彭菊艳等，2006）。金银花叶含有较多的氧化酶，高温能灭活金银花叶中各种酶，使绿原酸、木犀草苷的损失达到最小化（陈燕文等，2017）。然而，绿原酸是一种极性有机酸酯，其性质不稳定且易于分解（谢娟平等，2015） 。长时间强光及高温干燥使绿原酸结构遭到破坏，从而使其含量降低（何希瑞等，2013）。与绿原酸类似，木犀草苷结构中也含有多个酚羟基，对热的稳定性也较差。从干燥工艺来看，真空干燥应该优于其他干燥方式，但试验结果恰恰相反，这可能是由于真空干燥后得到的产品膨松多孔而使金银花叶极易被氧化所致（陈德经，2006）。金银花叶中的氧化酶对有机酸类成分的氧化起到了催化作用，所以总有机酸的损失相对较多。高温还可促使金银花叶中分解黄酮的氧化酶失活，又进一步减少了黄酮类成分的破坏（石晓晨等，2018）。但是过高的温度会破坏总酚酸和总黄酮结构，使其含量降低。总黄酮、总酚酸和总环烯醚萜苷含量于70 ℃烘干时含量达到最低，80 ℃和100℃烘干后含量上升，可能是由于在加热过程中某些物质发生了成分的分解转化，影响了总黄酮、总酚酸和总环烯醚萜苷的含量。

4 结论

本试验结果表明，除木犀草苷外，在40 ℃烘干时5 种成分含量均呈现出最大值，此外总黄酮、总酚酸、总环烯醚萜苷三种成分同时在阴干和40 ℃烘干时呈现出较高含量。随着烘干温度的升高，大多数有效成分的含量在70 ℃烘干时最低，80 ℃和100 ℃烘干时含量呈现上升趋势，这个上升过程是否是由于加热使金银花叶内的成分发生分解转化，或是由于高温使金银花叶结构发生改变，释放出所测成分还有待于进一步试验研究。