固态发酵玉米黄粉饲料工艺的研究

江成英，刘晓兰，王 松

（1.梧州学院化学工程与资源再利用学院，广西梧州 543000；2.齐齐哈尔大学食品与生物工程学院，黑龙江齐齐哈尔 161006）

玉米黄粉也称玉米蛋白粉，是加工玉米淀粉的副产物之一。玉米蛋白粉中的蛋白质有两种状态，即可溶性蛋白质和不可溶性蛋白质，不溶性蛋白质容易和其他的大分子有机物或微量元素结合，而不易被身体吸收，几乎均被排出体外（ 赵文扬等，2014）。玉米蛋白粉因不溶性蛋白质含量较高及氨基酸组成极不平衡，利用价值及营养品质较低，严重制约其在饲料中的应用（佟维娜等，2017；晏家友等，2009；王冠禹等，2008）。对玉米蛋白粉进行加工处理，充分发掘其潜在价值，既可节约能源，又能够促进玉米产业的发展（陆启明等，2018；李丽等，2010）。

利用微生物发酵可提高玉米蛋白粉饲料的利用率（江成英，2018）。微生物发酵过程中产生的蛋白酶类能够将蛋白粉中难以被吸收利用的植物大分子蛋白质降解为分子质量较小的多肽、 小肽或游离氨基酸，从而改善玉米蛋白粉的营养结构，并产生具有多种生理活性的肽类，增强动物免疫力（魏炳栋，2017）。本研究以玉米黄粉为主要原料，以多菌种组合制备的种曲为发酵剂进行发酵饲料的制备，在单因素试验的基础上，采用四因素三水平的正交试验，旨在优化固态发酵玉米黄粉饲料的工艺条件。

1 材料与方法

1.1 主要材料 种曲：本项目组制备；玉米黄粉：中粮生化能源（龙江）有限公司提供；麸皮：市售。

1.2 主要试剂 碳酸钠、氢氧化钠、硫酸铜、酒石酸钾钠、钨酸钠、钼酸钠、磷酸、盐酸、硫酸锂、液溴、葡萄糖、琼脂、胰蛋白胨、氯化钠、酵母粉等试剂均为国产分析纯。

1.3 主要仪器 隔水式电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂），显微镜（宁波永新光学股份有限公司），手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂），紫外可见分光光度计（日本岛津仪器厂），移液器 （北京青云卓立精密设备有限公司），数显pH 计（上海精密科学仪器有限公司），超净工作台（上海智城分析仪器有限公司），电子天平（北京赛多利斯仪器厂）等。

1.4 试验方法

1.4.1 可溶性蛋白质含量的测定 采用福林酚法测定可溶性蛋白质含量（王永华，2010）。

1.4.2 种曲的制备 将枯草芽孢杆菌、热带假丝酵母菌、嗜热乳杆菌、纳豆芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌按3:3:1:4:2 比例混合，以5%的接种量接入料水比为 1：1.6、物料比（黄粉：麸皮）为 4：6 灭菌的培养基上，在30 ℃恒温条件下培养84 h （江成英，2018）。

1.4.3 单因素试验 将玉米黄粉与麸皮以一定比例混合制备发酵培养基，接种种曲进行固态发酵，以发酵过程中可溶性蛋白质含量为指标进行发酵条件的确定。本试验在饲料的制备过程中主要研究了物料比、料水比、发酵温度、发酵时间、接种量对可溶性蛋白质含量的影响。

1.4.4 正交试验设计 在单因素试验的基础上，对料水比、接种量、发酵时间以及发酵温度设计四因素三水平 L9（34） 的正交优化试验，以确定固态发酵玉米黄粉饲料的工艺条件。

1.4.5 发酵验证试验 对正交试验获得的最佳发酵条件进行发酵验证。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验

2.1.1 发酵时间对可溶性蛋白质含量的影响首先发酵时间进行单因素优化试验，发酵条件为黄粉：麸皮=7：3，料水比为 1：1.2，种曲的接种量为5%，发酵温度为30 ℃。48 h 以后每隔12 h检测发酵底物中的可溶性蛋白质含量。可溶性蛋白质含量及蛋白转化率随发酵时间变化的关系如图1 所示。

图1 发酵时间对可溶性蛋白含量的影响

如图1 所示，随着发酵时间的延长，发酵底物中的可溶性蛋白质含量不断增加，当时间为96 h时达到最大值10.85%。超过96 h 以后，可溶性蛋白质含量有所下降，在120 h 以后可溶性蛋白质含量又略有提高。这主要是由于发酵前期，培养基中营养物质充足菌群大量繁殖，产蛋白酶能力迅速提高，从而使发酵底物中非水溶性蛋白质不断转化，随着菌种量的增加，消耗发酵底物中营养速度也不断增大；到了发酵后期发酵底物中的营养物质已不能满足菌群生长及产蛋白酶的需求，因此菌群产蛋白酶活力降低，进而可溶性蛋白质含量下降，超过120 h 之后一些菌体的自溶使得可溶性蛋白质含量略有升高。综合考虑，确定96 h为最佳的发酵时间。

2.1.2 发酵温度对可溶性蛋白质含量的影响 在黄粉：麸皮=7：3，料水比为 1：1.2，种曲的接种量为5%，发酵时间为96 h 条件下对发酵温度进行了优化试验，设置了 28、30、32、34 ℃四个温度梯度，每个梯度设置三个平行样，发酵结束后，通过福林酚法检测可溶性蛋白质含量并计算蛋白转化率，从而确定发酵生产蛋白饲料的最佳发酵温度。结果如图2 所示。

图2 发酵温度对可溶性蛋白含量的影响

由图2 可知，各温度梯度对发酵底物中可溶性蛋白质含量的影响不明显，主要原因可能是在28～34 ℃都能适用于蛋白酶发挥催化活力，但在32 ℃时发酵底物中可溶性蛋白质最高，为11.41%，故确定发酵温度为32 ℃。

2.1.3 物料比对可溶性蛋白质含量的影响 在料水比为1：1.2，种曲的接种量为5%，发酵时间为96 h，发酵温度为32 ℃的条件下，设置了黄粉：麸皮为 4：6、5：5、6：4、7：3、8：2 五个梯度来研究物料比对发酵饲料中可溶性蛋白质含量的影响。结果如图3 所示。

图3 物料比对可溶性蛋白含量的影响

从图3 可以看出，随着物料中玉米蛋白粉含量的增加，发酵底物中可溶性蛋白质含量逐渐升高，至黄粉：麸皮为7：3 时达到最高，为11.43%。而再增加玉米蛋白粉的含量反而使可溶性蛋白质含量有所下降。这主要是由于碳氮比降低时菌种产蛋白酶能力较强，从而使水溶性蛋白质水解率增大，但玉米蛋白粉过多会导致发酵底物透气性差，使微生物生长受限而影响蛋白酶的产量，进而使可溶性蛋白质含量下降。因此，确定最适物料比黄粉：麸皮为 7：3。

2.1.4 接种量对可溶性蛋白质含量的影响 在料水比为 1：1.2，物料比（黄粉：麸皮）为 7：3，发酵时间为96 h，发酵温度为32 ℃的条件下，对种曲的接种量进行了优化，每组三个平行样，可溶性蛋白质含量测定结果如图4 所示。

图4 接种量对可溶性蛋白含量的影响

由图4 可知，种曲的接种量增加时底物中的可溶性蛋白质含量随之增加。当种曲接种量为5%时，底物中的可溶性蛋白质含量为11.42%。但当接种量超过5%时，底物的可溶性蛋白质含量增加不大，从生产成本考虑选取接种量5%为发酵饲料种曲的接种量。

2.1.5 料水比对可溶性蛋白质含量的影响 在物料比（黄粉：麸皮）为 7：3，发酵时间为 96 h，发酵温度为32 ℃，种曲的接种量为5%的条件下，对物料的料水比进行了优化，设置了 1：1、1：1.2、1：1.4、1：1.6 四个梯度，每组三个平行样，发酵结束后检测可溶性蛋白质含量，结果如图5 所示。

图5 料水比对可溶性蛋白含量的影响

由图5 可以看出，随着物料中加水量的逐渐增多，可溶性蛋白质含量随着增加，料水比为1:1.4 时，可溶性蛋白质含量最高，为13.08%。说明在此条件下，培养基中的含水量既可以满足菌体生长的需要，又不会影响物料的发酵，是一个较为理想的比例。

2.2 正交试验结果分析 通过单因素试验得出，固态发酵玉米黄粉饲料的条件为物料比（黄粉：麸皮）7：3，发酵时间 96 h，发酵温度 32 ℃，种曲的接种量5%，料水比1：1.4。在此基础上设计了四因素三水平L9（34）的正交试验，对各因素组合进行优化。正交试验设计和试验结果如表1 所示。

表1 正交试验设计与结果

由表1 分析可以看出，固态发酵玉米黄粉饲料的最佳条件为A2B2C3D3，即料水比为1:1.4，接种量为5%，发酵温度为33 ℃，发酵时间为108 h。

2.3 发酵验证试验结果 将玉米黄粉与麸皮以7:3 的比例混合，按 1.4 的比例（g/mL）加入水，混匀后于121 ℃蒸汽灭菌30 min，冷却至室温，接入5%的种曲，置于33 ℃条件下108 h，测定其中可溶性蛋白质含量为13.67%。

3 结论

本研究通过正交试验确定了固态发酵玉米黄粉饲料的工艺条件为物料比（黄粉：麸皮）7：3，料水比 1：1.4，发酵时间 108 h，发酵温度 33 ℃，种曲接种量5%。该条件下发酵玉米黄粉饲料中可溶性蛋白质含量为13.67%。