家族性皮质肌阵挛震颤性癫痫2p11.1-q12.2和3q26.32-3q28基因位点的连锁分析

刘彩霞，孙 维，田智敏，史宝和，居乃新，陈秋惠

家族性皮质肌阵挛震颤性癫痫(Familial cortical myoclonic tremor with epilepsy，FCMTE)是一种罕见的常染色体显性遗传疾病。近年来，国内外研究者将FCMTE致病基因进行了粗略的定位。目前，已发现了多个该病的致病基因位点，但因该病具有遗传异质性，是否存在其他致病基因位点仍需进一步研究。本课题组对已报道的8q23.3-24.1和10p15致病基因位点进行连锁分析，结果未发现该病的致病基因与上述2个基因位点连锁[1]。本文继续对2p11.1-q12.2和3q26.32-3q28这2个致病基因进行连锁分析。

1 资料与方法

1.1 一般资料 我们已报道的临床确诊的家族性皮质肌阵挛震颤性癫痫一家系[2]，患者7例和对照者13例(患者的直系亲属及配偶，其中1例为可疑病例)。确诊的患者临床特点符合以下诊断标准[3]：①连续3代发病，呈常染色体显性遗传，男女均受累，均成年起病；②主要表现为癫痫发作，部分患者在光刺激、惊吓或情绪刺激时诱发全面强直发作，伴肢体远端震颤；③口服苯巴比妥等抗癫痫药物有效，口服β受体阻滞剂无效，为非进展病程；④躯体感觉诱发电位检查支持震颤来源于皮质。

1.2 研究方法与试剂

1.2.1 样品采集与DNA提取 在获得受试者知情同意后采其外周血5 ml，用家系编号，详细标记血样。利用血液基因组DNA提取试剂盒(天根)提取各样本基因组DNA。

1.2.2 选择与设计微卫星引物 我们根据已报道的2p11.1-q12.2和3q26.32-3q28染色体位点，在NCBI mapview图谱中找到这些区域中合适遗传距离的STR(见表1)。

1.2.3 PCR反应、产物处理、毛细管电泳及结果收集 对选择的STR位点分别合成5’标记FAM的荧光引物及普通引物，然后进行荧光引物标记的PCR反应。在ABI PRISM 3730 DNA Analyzer上用PE公司的POP-4分离胶，15 KV、60 ℃下，电泳30 min，选用ABI PRISM GeneMapper Software(Ver 3.5)收集实验数据，进行分子量内标校正和扩增片段大小分析，并读取全部微卫星标记物等位基因片段的大小。

1.2.4 基因型分析及连锁分析 利用GeneMapperV3.5进行基因分型，确定家系中各个样本在每个STR标记处的分型情况。在Linkage5.1软件中设定疾病基因频率、疾病外显率及拟表型频率，θ=0～0.5进行连锁分析，记录优势对数记分(log odds score，LOD)。

2 结 果

我们分别在2p11.1-q12.2和3q26.32-3q28染色体区段各选取的4个STR位点，在θ=0.0时这些STR位点与致病基因的两点LOD值均<-2，具体分析结果见表2、表3。

表1 2p11.1-q12.2和3q26.32-3q28染色体位点所选择的STR信息及引物序列

注：F：Forward primer；R：Reverse primer

表2 2p11.1-q12.2染色体区段STR位点与该家系致病基因两点连锁分析

表3 3q26.32-3q28染色体区段STR位点与该家系致病基因两点连锁分析

3 讨 论

家族性皮质肌阵挛震颤性癫痫(familial cortical myoclonic tremor with epilepsy，FCMTE)是一种少见的遗传性癫痫综合征，又称良性成人家族性肌阵挛性癫痫(benigh adult familial myoclonic epilepsy，BAFME)、家族性成人肌阵挛癫痫(familial adult myoclonic epilepsy，FAME)等，是一种具有临床异质性和遗传异质性的常染色体显性遗传疾病。目前，世界对该病家系的报道仅有100多个，主要分布在意大利和日本两国，日本报道的家系已超过60例，荷兰、意大利、土耳其等国家也有相关报道。近年来，我国也对该病家系陆续做了报道。随着遗传学研究工作的不断深入，该病逐渐被人们重视起来。

早些年，日本和意大利研究者将FCMTE家系的致病基因粗略的定位于8q23.3-24.1和2p11.1-q12.2，但遗传分析结果显示相关致病基因与上述两个基因位点不连锁[4，5]。近年来，5p15.31-p15、3q26.32-3q28和10p15等多个基因位点陆续在法国、泰国和中国被发现[6，7]。Cen等在FCMTE家系中发现SAMD12基因内含子区(TTTGA)n插入突变；在SAMD12中，非编码TTTCA和TTTTA 重复序列的扩增被认为是与8q24相关的亚洲FCMTE家系的主要致病原因[8～15]。本研究采用的是基于家系研究的连锁分析方法，利用连锁的原理研究致病基因与遗传标记的关系，是对该疾病的相关基因位座不明而采用的遗传分析手段。连锁分析包括实验分析和数据分析两个方面。优势对数记分法(log odds score method，LOD法)是数据分析最常用的统计学方法。用优势对数记分法进行分析需要准备以下方面的资料，即家族史调查、诊断资料、遗传标记物资料及分型信息。本文即是对已报到的 FCMTE 家系的基因定位研究进行报道。常用的DNA分子遗传标记物包括单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNP)、限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)和短串联重复序列(short tandem repeat，STR)。本研究选取的DNA分子遗传标记物为STR。STR是基因组中由2-6个碱基作为核心单位的短串联重复结构，又称微卫星DNA(micro satellite DNA)，是一种可遗传、具有高度多态性的短串联重复序列，遵循孟德尔遗传定律呈显性遗传，其具有在基因组中分布广泛、高度多态性、基因片段短、扩增效率高、判型准确等特点。判断连锁的标志是当LOD>1时，表示存在连锁；LOD>3时，表示肯定连锁；LOD<-2时，表示否定连锁；通常-23是必要的。我们的实验已针对国内外报道的8q23.3-q24.1和10p15对应短臂2-8 M区段的多个STR标记进行连锁分析，结果显示不支持连锁，说明我们的家系致病基因并不在这两个染色体区[1]。本文继续针对2p11.1-q12.2和3q26.32-3q28各选择4个STR标记进行连锁分析，结果显示在θ=0.0时，我们分析的这些STR位点与致病基因的两点LOD值均<-2，由此推断此家系的致病基因位点不在2p11.1-q12.2和3q26.32-3q28。但还存在以下可能：(1)我们选择的STR位点在本家系的杂合率相对较低或由于STR标记在染色体区段密度相对小；(2)我们的家系样本量不足够大；(3)NCBI数据库的STR Marks 是以欧洲人群为模板的，STR具有人种和地域性，而杂合度受遗传背景的影响比较大，对我国人群针对性不够强，以致造成STR位点的等位基因变化范围、杂合度、重复单元等数据与数据库报道有一定出入。

总之，尽管本研究的实验结果为阴性，但为FCMTE的遗传学研究提供了一份良好的研究资料。我们在后续的研究工作中将尝试使用不同的连锁分析方法对分型结果进行分析，或继续在相应的区域增加样本量；或增加本病的其他家系，以累加LOD值；通过各种计算结果综合判断。