栀子苷对睡眠剥夺大鼠学习记忆的影响

曹 静 汪萌芽

睡眠剥夺(sleep deprivation，SD)是指各种因素所致的睡眠减少和睡眠时间严重不足，是由于自身生理、病理因素或环境的影响而影响了生理所需睡眠量的状态[1]。研究[2]显示，SD后人们出现学习记忆能力下降现象。栀子苷(geniposide)是从栀子的干燥成熟果实中提取制成的环烯醚萜苷类化合物，是栀子中发挥药效作用的主要成分[3]。有研究[4]表明，栀子苷能改善生物睡眠。但有关栀子苷对生物行为和认知影响的研究鲜有报道。为此，本研究通过建立SD大鼠模型，并给予不同剂量栀子苷干预，以期了解栀子苷对SD大鼠学习记忆的影响，为临床SD患者学习记忆的改善提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选择SPF级雄性Sprague -Dawley大鼠50只，购自南京市江宁区青龙山动物繁殖场,动物许可证号：SCXK(苏)2017-0001]，体质量200～250 g，10周龄。所有大鼠饲养条件一致：笼养，每天接受光照12 h,黑暗12 h，光照周期为8:00～20:00。实验温度为(20±2)℃，湿度60%，喂以大鼠标准饲料和清洁饮用水，大鼠可自由摄食、摄水。动物实验遵守国际实验动物伦理学要求。

1.2 设备与药品 Morris水迷宫水池由本实验室参照文献[5]自制；一个自制的不锈钢可视平台, 一个采用亚克力材料自制的透明不可视平台。两个平台均为直径10 cm、高30 cm的圆柱体。栀子苷原料药(合肥拜尔迪化学科技有限公司，分析标准品≥98%)。

1.3 动物分组、造模与鉴定 将大鼠适应性喂养一周之后称重，在体质量无差别情况下，利用随机数字表法分为5组：正常组10只，正常饲养不加任何处理；SD组10只，建立SD模型；栀子苷低剂量组10只，建立SD模型并给予低剂量栀子苷(10 mg/kg)干预；栀子苷中剂量组10只，建立SD模型并给予中剂量栀子苷(20 mg/kg)干预；栀子苷高剂量组10只，建立SD模型并给予高剂量栀子苷(40 mg/kg)干预。除正常组以外，对其他4组大鼠采用轻触+换笼方法[6]建立SD模型：即每天剥夺大鼠睡眠8 h(上午9点-下午5点)，连续7天，期间每小时换笼1次，每天换笼9次。在此期间，当大鼠出现点头、协靠、依靠或者打盹等现象时，给予大鼠刺激，用报纸轻轻拍打笼子，但要注意避免与大鼠直接接触。连续7天后按文献[7]进行SD模型验证:大鼠全身皮毛疏松，毛发发黄无光泽，并逐渐出现活动明显减少，打盹次数增多，对刺激敏感性降低，眼色暗红，激惹呈回避反应等，甚至同性骑行行为。按余群星[8]报道的方法对5组大鼠进行寻找平台训练，结果剔除了不符合实验条件的大鼠4只，即正常组和栀子苷低、中、高剂量组各一只。

1.4 给药方法 用药方法按照武海霞等[9]的研究进行，正常组、SD组分别予以灌胃蒸馏水(0.01 mL/kg)，栀子苷低剂量组灌胃栀子苷稀释溶液0.01 mg/mL，中剂量组为0.02 mg/mL，高剂量组为0.04 mg/mL，灌胃剂量均为0.01 mL/g。

1.5 观察指标 栀子苷干预一周后，采用Morris 水迷宫测试5组大鼠第1天至第7天逃避潜伏期、穿越平台次数及第一次到达原平台时间。

1.5.1 水迷宫建立 参照文献[5]自制Morris水迷宫水池，即直径120 cm高 50 cm的不锈钢圆形水池, 十字均分为4个虚拟象限，2个平台可置于同一任意一个象限中央。

1.5.2 逃避潜伏期检测 按余群星[8]报道的方法进行逃避潜伏期检测。将5组大鼠从4个象限的任一象限面向池壁放入水中，每个象限测试一次，若大鼠能找到并登上平台，在平台上停留5 s后则停止记录，记录的大鼠找到平台在水中消耗的时间记为逃避潜伏期；若大鼠60 s内未找到平台，则停止计时后由实验者引导其登上平台并停留15 s，此时的逃避潜伏期计为60 s。连续检测7天。逃避潜伏期长表示大鼠学习能力降低。

1.5.3 穿越平台次数及第一次到达原平台时间检测 连续7天逃避潜伏期检测结束1 h后, 撤掉平台,将大鼠从原平台所在象限的对侧象限放入水中，检测大鼠在60 s内穿过原平台所在位置的次数(穿越原平台次数)及第一次到达原平台的时间。穿越原平台次数少及第一次到达原平台的时间长表示大鼠的记忆能力降低。

2 结果

2.1 5组大鼠逃避潜伏期比较 栀子苷干预一周后，5组大鼠第一天至第7天的逃避潜伏期比较，不同时间、组间、组间及时间的交互效应差异均有统计学意义(P<0.05)。因本重复测量资料不满足球形度检验，故采用Greenhouse-Geisser进行检验。与正常组大鼠比较，SD组大鼠第一天到第7天逃避潜伏期明显延长，差异均有统计学意义(P<0.05)。与SD组比较，栀子苷低、中、高剂量组逃避潜伏期缩短，差异有统计学意义(P<0.05)。栀子苷低剂量组逃避潜伏期长于栀子苷中、高剂量组，栀子苷中剂量组逃避潜伏期长于栀子苷高剂量组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 5组大鼠第一天至第7天逃避潜伏期比较

注：同一时间不同组间的比较，符号(a，b，c，d)完全不同表示P<0.05;与第1天比较，*P<0.05;与第2天比较，P<0.05;与第3天比较，P<0.05;与第4天比较，P<0.05;与第5天比较，P<0.05

2.2 5组大鼠穿越平台次数及第一次到达原平台时间的比较 5组穿越平台次数、第1次抵达原平台时间的组间差异均有统计学意义(P<0.05)。与正常组比较，SD组大鼠穿越原平台次数均明显减少，第1次抵达原平台时间均明显延长，差异有统计学意义(P<0.05)；与SD组比较，栀子苷低、中、高剂量组大鼠穿越平台次数均明显增多，第1次抵达平台时间明显缩短，差异有统计学意义(P<0.05)。与栀子苷低剂量组比较，栀子苷中、高剂量组穿越平台次数增多，第一次到达原平台时间延长；栀子苷中剂量组穿越平台次数少于栀子苷高剂量组，第一次到达原平台时间长于栀子苷高剂量组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 5组大鼠穿越平台次数及第一次到达原平台时间比较

注：与正常组比较，*P<0.05；与SD组比较，#P<0.05；与栀子苷低剂量组比较，P<0.05；与栀子苷中剂量组比较，P<0.05

3 讨论

睡眠是人类维持正常生命不可或缺的生理活动，一旦发生SD，则会导致机体发生一系列改变，包括生理、心理以及病理、行为学异常等[10]。目前对于SD的治疗，多采用镇静、催眠作用的精神类药物，长期服用此类药物可导致耐药性，最终影响神经系统功能[11]。而中药制剂毒性作用低且能标本兼治，既不会成瘾，也不会产生依赖性[12]。栀子苷是从栀子的干燥成熟果实中提取，其主要成分为环烯醚萜类化合物。栀子苷能改善生物睡眠[4]，药理学研究[13-15]表明，栀子苷具有抗老年痴呆功效，可明显改善学习记忆功能。本研究探讨栀子苷对SD大鼠学习记忆的影响，以期为临床对抗SD人群学习记忆能力下降提供药物治疗依据。

有研究[16]显示，10周龄雄性SD大鼠的学习记忆能力相对稳定，故本研究选择此类型大鼠为实验对象。本组资料显示，SD组大鼠第1天至第7天的逃避潜伏期长于正常组，SD组大鼠穿越平台次数少于正常组、第1次抵达原平台时间长于正常组(P均<0.05)，表明SD大鼠存在学习记忆力下降。此与甘丽[17]的研究结果一致，这可能是与一氧化氮合酶在前额和海马中的神经元表达水平下降有关。具有神经毒性的一氧化氮合酶在SD后浓度增加，使得应激强度过大，导致神经元损伤[18]。

本研究还发现，与SD组比较，栀子苷低、中、高剂量组大鼠逃避潜伏期缩短(P<0.05)。栀子苷低剂量组大鼠逃避潜伏期长于栀子苷中、高剂量组(P<0.05)，说明对SD大鼠进行栀子苷干预后，大鼠学习能力得到了一定程度的改善。与SD组比较，栀子苷低、中、高剂量组大鼠穿越平台次数均增多(P<0.05)，第一次抵达平台时间缩短(P<0.05)，且栀子苷剂量越高，大鼠穿越平台次数越多及第一次抵达平台时间越短，表明栀子苷干预剂量对SD大鼠记忆能力的改善有影响，剂量相对较高时改善效果更好。此与陈安春等[19]的研究结果较为一致。这可能是SD后可引起大鼠代谢增加、自主神经系统功能紊乱等, 而生物体内一些重要神经递质如一氧化氮、多巴胺、5-羟色胺、乙酰胆碱、自由基等的改变, 都与学习记忆密切相关[18]。因此SD后学习记忆能力下降可能与SD后脑内神经递质的改变有关。栀子苷能降低氧化应激伤害，增加脑源性神经营养因子和胶质细胞源性神经营养因子的释放[20]，起到神经保护作用，从而改善学习记忆[21]。

综上所述，栀子苷能改善SD大鼠的学习记忆能力，且高剂量组栀子苷可以明显缩短逃避潜伏期和大鼠寻找平台的时间，同时也增加SD大鼠的探究行为。由于本研究只进行了行为学观察，其具体机制有待今后进一步深入研究。