基于双荧光和单荧光探针的溶酶体pH值测定方法比较

姚溢，刘萱

军事医学研究院 生物工程研究所，北京 100850

溶酶体是一种直径0.025～0.8 μm、单层膜包被且形态多样的酸性细胞器，存在于所有真核细胞的细胞质中。溶酶体内含60多种酸性水解酶，其作用是分解由胞外进入胞内或细胞自身产生的各类物质，甚至包括受损的细胞器。溶酶体内酸性水解酶的活性依赖于其低pH值环境。正常情况下，溶酶体通过水解ATP产生能量，驱动膜表面的V型ATP酶（V-ATPase）质子泵复合物，将胞质中的氢离子逆浓度梯度运输到溶酶体内，使溶酶体内的pH值维持在4.5～5.0[1-3]。研究发现，可透膜直接调节溶酶体酸度的弱碱性小分子化合物NH4Cl或氯喹、V-ATP酶质子泵抑制剂巴弗洛霉素A1等，都可以使溶酶体的pH值上升，从而破坏其水解功能。生理状态下，溶酶体低pH值环境受损会导致癌症、休克、类风湿性关节炎、阿尔茨海默症和其他神经退行性疾病等[4-8]。因此，溶酶体pH值的检测在科学研究和疾病诊断中具有重要意义。

目前，溶酶体pH值检测方法主要包括酸碱指示剂滴定法、核磁共振法、微电极法和荧光探针检测法[8-11]。因为荧光探针检测法具有分辨率高、选择性好、灵敏度高、操作简单、对细胞无损伤、可实时监测等特点[12-15]，且有多种荧光探针可供选择，因此被广泛使用[16-17]。

荧光探针法多是基于荧光基团的结构或发射光谱会随环境酸碱度的变化而发生变化来监测pH值。如基于异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）的pH值测定方法中，当激发光波长在490 nm附近时，FITC在535 nm的发射光强度对环境pH值极其敏感，pH值越高，荧光强度越强，反之则越弱[18]。而四甲基若丹明（tetramethyl rhodamine，TMR）则是一种对pH值几乎不敏感的荧光染料，可用于FITC荧光强度矫正。为了使FITC或TMR荧光分子聚集于溶酶体，可将荧光分子与相对分子质量大于10万的葡聚糖（dextran）分子交联，制备成FITC/TMR-dextran荧光探针，利用细胞自身的内吞作用，通过内体将荧光探针送入溶酶体。FITC-dextran与TMR-dextran荧光探针在不同条件下荧光强度的比值可精确反映溶酶体的pH值。但是，基于双荧光染料比值的检测方法可能会因成像过程中光淬灭敏感性差异、染料渗漏等因素而产生系统误差，从而产生除pH值变化以外的影响[19]。

为避免双荧光探针可能带来的系统误差，我们尝试利用FITC-dextran单荧光探针进行pH值检测。相较于FITC在Ex488 nm/Em520 nm的荧光强度对pH值极为敏感，其在非峰值激发波长下（如Ex405 nm/Em422 nm）的荧光强度则不受pH值影响[18]。通过获取FITC-dextran荧光探针在Ex488 nm/Em520 nm和Ex405 nm/Em422 nm下荧光强度的比值（FIFITC488/FIFITC405）来测定溶酶体的pH值，可以有效避免不同种荧光探针之间因光淬灭敏感性差异或串色等因素带来的误差。

本研究利用pH值标准品，在A549细胞中比较了基于FITC/TMR-dextran双荧光和FITC-dextran单荧光探针的溶酶体pH值检测方法，证明利用FITC-dextran在488和405 nm双激发条件下的荧光强度比值同样可实现pH值的线性检测，且更加简便经济，可为溶酶体活性相关研究和相关疾病诊断提供帮助。

1 材料与方法

1.1 材料

人类肺癌肺泡基底上皮细胞系A549购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心,由本实验室保存。该细胞用DMEM完全培养基（含10%胎牛血清）在37℃、5%CO2条件下培养，待细胞长满后用胰蛋白酶消化传代，每周传代3次。

胰蛋白酶、FITC交联的葡聚糖分子（FITC-dextran）（Sigma公司）；巴弗洛霉素 A1（bafilomycin A1）（EMD Millipore公司）；DMEM培养基、胎牛血清（Gibco公司）；细胞内pH校准缓冲液试剂盒（Invitrogen公司）；TMR交联的葡聚糖分子（TMR-dextran）、溶酶体探针（LysoTracker）（Invitrogen公司）。

1.2 FITC/TMR双荧光探针法

1.2.1 溶液配制

①pH标准品溶液：将100 μL缬氨霉素（20 mmol/L）和100 μL尼日利亚菌素（20 mmol/L）混合成10 mmol/L的预混液（1000×）。缬氨霉素和尼日利亚菌素都可以与钾离子形成脂溶性复合体，在脂膜上促进氢离子和钾离子的交换，使细胞（包括溶酶体）内外pH值相等。分别在10 mL的 pH 标准品缓冲液 A（pH4.5）、B（pH5.5）、C（pH6.5）、D（pH7.5）中加入10 μL预混液，制成标准品溶液A、B、C、D。

②活细胞成像（live cell imaging solution，LCIS）缓冲液：140 mmol/L NaCl，2.5 mmol/L KCl，1.8 mmol/L CaCl2，1.0 mmol/L MgCl2，20 mmol/L HEPES，pH7.4，渗透压300 mmol/L。

③巴弗洛霉素A1：用160 μL超纯水溶解10 μg巴弗洛霉素A1并混匀，制成100 μmol/L的巴弗洛霉素A1母液。

1.2.2 荧光探针标记 在共聚焦专用培养皿中用DMEM完全培养基（含10%胎牛血清）培养A549细胞，待细胞长到50%汇合度时，在避光条件下向培养基中加入FITC-dextran（终浓度1 mg/mL）与TMR-dextran（终浓度0.5 mg/mL）荧光探针，轻轻混匀，37℃避光孵育2 h；随后，吸除含有荧光探针的培养基，用新鲜培养基轻柔地洗3次，彻底去除未进入细胞的荧光探针；加入新鲜培养基继续避光培养6 h，使荧光探针有充足的时间通过内吞作用经由内体进入溶酶体。

1.2.3 激光共聚焦检测 首先检测商品化pH值标准品的荧光强度，用于制作荧光强度与pH值相对应的标准曲线。镜检前吸去培养基后分别加入pH值为4.5、5.5、6.5、7.5的标准品溶液A、B、C、D，37℃避光孵育10 min，然后置于激光共聚焦显微镜（Carl Zeiss LSM880）63倍油镜下，分别用Ex488 nm/Em520 nm（FITC）和 Ex561 nm/Em580 nm（TMR）荧光通道进行观测并拍照，每个样品至少拍摄30个完整细胞用于后续图像分析。在实际细胞样品溶酶体pH值检测时，镜检前须吸去培养基并加入LCIS缓冲液，随后置于激光共聚焦显微镜63倍油镜下，用相同的荧光通道和成像参数进行观测并拍照。溶酶体pH值调节药物巴弗洛霉素A1在镜检前6 h加入，终浓度为100 nmol/L。

1.2.4 溶酶体pH值的计算 使用ImageJ软件统计至少30个完整细胞内FITC和TMR的荧光强度，通过计算其平均荧光强度（fluoresces intensity，FI）比值FIFITC488/FITMR561制作荧光强度相对于pH值的标准曲线（分别以pH4.5标准品的FIFITC488和FITMR561为基准，对各项数据进行归一化处理后再制作标准曲线和回归方程），并通过回归方程计算各个处理组细胞相对应的溶酶体pH值。

1.3 FITC单荧光双激发法

FITC单荧光双激发法与FITC/TMR双荧光探针法类似。但存在以下不同：①荧光探针标记时，只加入FITC-dextran（终浓度为1 mg/mL）单荧光探针；②激光共聚焦检测时，分别用Ex488 nm/Em520 nm（pH敏感）和Ex405 nm/Em422 nm（pH不敏感）荧光通道进行观测并拍照；③在pH值计算时，使用ImageJ软件统计至少30个完整细胞内FITC双通道激发的荧光强度，通过计算其平均荧光强度比值FIFITC488/FIFITC405制作标准曲线（分别以pH4.5标准品的FIFITC488和FIFITC405为基准，对各项数据进行归一化处理后再制作标准曲线和回归方程），并通过回归方程计算各个处理组细胞相对应的溶酶体pH值。

2 结果

2.1 葡聚糖交联的荧光探针通过细胞内吞标记溶酶体

高分子量葡聚糖dextran被细胞内吞后经过内体运输到达溶酶体，且几乎不被降解。利用这一特性，与dextran交联的荧光分子可最终被运送至溶酶体。因此，要准确测量溶酶体pH值，必须首先保证荧光探针-dextran完全聚集于溶酶体中。不同细胞内吞的速率不同，所以应首先确定A549细胞中荧光探针-dextran进入溶酶体所需的时间。我们在细胞培养基中加入FITC-dextran荧光探针，孵育2 h后彻底洗掉未进入细胞的探针，并在正常培养基中继续培养不同的时间。与此同时，在镜检前90 min用靶向溶酶体的Lyso-Tracker染料对溶酶体进行活细胞标记，通过激光共聚焦显微镜检测不同时间点FITC-dextran（Ex488 nm/Em520 nm）与 LysoTracker（Ex577 nm/Em590 nm）的共定位。结果显示，FITC-dextran标记6 h后与溶酶体的共定位最强（图1）。用ImageJ软件分析红绿荧光的共定位比例，FITC-dextran标记6 h与溶酶体共定位的皮尔森相关系数可达0.7034（图1），可用于溶酶体pH值测定。

2.2 利用FITC/TMR双荧光探针法测定溶酶体的pH值

确定A549细胞中FITC-dextran荧光探针进入溶酶体的最佳时间之后，利用FITC/TMR双荧光探针法测定A549细胞溶酶体的pH值。在培养基中同时加入终浓度为1 mg/mL的FITC-dextran与终浓度为0.5 mg/mL的TMR-dextran荧光探针，孵育2 h后彻底洗掉未进入细胞的探针，加入新鲜培养基继续培养6 h。随后，分别加入pH值为4.5（A）、5.5（B）、6.5（C）、7.5（D）的 pH 值标准品，制作荧光强度相对于pH值的标准曲线。激光共聚焦检测发现，FITC在Ex488 nm/Em520 nm的荧光强度随pH值的升高而显著加强，而TMR在Ex561 nm/Em580 nm的荧光强度受pH值的影响较小（图2A），二者的相对荧光强度比值FIFITC488/FITMR561与pH值基本呈线性关系（图2B）。

随后，利用溶酶体pH值调节剂巴弗洛霉素A1（100 nmol/L）处理经 FITC-dextran与TMR-dextran标记的细胞，并通过激光共聚焦检测FITC和TMR的荧光强度（图2C）。利用标准曲线的回归方程计算其相对应的pH值。结果显示，与无药物处理的生理组细胞相比，经巴弗洛霉素A1处理的细胞中溶酶体pH值由生理状态下的4.6升高至6.9（图2D）。

2.3 利用FITC单荧光双激发法测定溶酶体pH值

FITC与TMR在检测过程中都存在荧光淬灭衰减现象，且二者淬灭速率不同，会给FITC/TMR双荧光探针法带来一定的系统误差。已有研究发现，FITC荧光强度对pH值的敏感性依赖于激发光波长，其在488 nm激发光下对pH值的敏感性最强，而在405 nm激发光下的荧光强度几乎不受pH值的影响[18]。为了避免双荧光探针的系统误差，我们尝试利用FITC-dextran单荧光探针在488 nm和405 nm激发光下的相对荧光强度的比值计算pH值。在培养基中加入终浓度为1 mg/mL的FITC-dextran标记细胞溶酶体，随后加入pH值标准品，制作pH值标准曲线。激光共聚焦检测发现，FITC在Ex488 nm/Em520 nm的荧光强度随pH值的升高而显著加强，而在Ex405 nm/Em422 nm的荧光强度受pH值影响较小（图3A），二者相对荧光强度的比值FIFITC488/FIFITC405与pH值基本呈线性关系（图3B）。同样，利用溶酶体pH值调节剂巴弗洛霉素A1（100 nmol/L）处理经FITC-dextran标记的细胞，检测结果显示，与无药物处理的生理组细胞相比，经巴弗洛霉素A1处理的细胞中溶酶体pH值由生理状态下的4.5升高至7.6（图3D），其pH检测敏感性与FITC/TMR双荧光探针法一致。

图1 利用FITC-dextran荧光探针标记溶酶体

值得注意的是，在标准曲线制作中，作为背景对照的FIFITC405本身也与pH值呈一定程度的负相关，但其负相关斜率绝对值0.1815和FITMR561与pH值的负相关斜率绝对值0.1625基本一致，说明TMR与FITC405受pH值的影响基本相同（图4A）。而且在这2种方法测量标准曲线的过程中，FIFITC488随pH值变化的趋势重复性好（图4B），说明FITC单荧光双激发法可替代FITC/TMR双荧光探针法进行溶酶体pH值的测定。由于FITC单荧光双激发法只须使用1种荧光探针，实验步骤相对简单，其实验过程中产生人为操作误差的概率也更低，因此更有利于pH值的定量检测。

图2 FITC/TMR双荧光探针法测定溶酶体的pH值

3 讨论

溶酶体是调控细胞代谢的重要细胞器[20]，检测溶酶体的pH值是研究其功能和相关疾病诊断的基础。利用荧光探针检测溶酶体的pH值已被被广泛使用，其中又以基于FITC的检测法最为普遍。本研究结合实验室实际情况，在A549细胞中比较了基于双荧光素和单荧光素的pH检测法。

目前常用的检测溶酶体pH值的方法是FITC/TMR双荧光探针法，但FITC与TMR的荧光淬灭衰减速率存在差异，且不同光谱间易发生串色，可能导致潜在的系统误差。在FITC单荧光双激发法中，作为矫正荧光，FIFITC405表现出与FITMR561一致的pH值敏感性，在检测巴弗洛霉素A1对溶酶体pH值的影响时，2种方法计算得出的pH标准曲线以及溶酶体pH值高度一致，说明FITC单荧光双激发法可替代FITC/TMR双荧光探针法来进行溶酶体pH值的定量检测。由于FITC本身的荧光淬灭并不会影响其在488和405 nm激发光情况下的发射光荧光强度的比值，提示FITC单荧光双激发法潜在的系统误差更小。此外，FITC单荧光双激发法的实验过程更为简便经济[21-23]。

图3 FITC单荧光双激发法测定溶酶体的pH值

图4 比较FITC/TMR双荧光探针法与FITC单荧光双激发法对pH值的敏感性

综上所述，FITC单荧光双激发法可以替代FITC/TMR双荧光探针法，其检测效果符合实验室后续试验检测溶酶体pH值的需求，而且操作更简单，也更加经济便宜。本研究为细胞中溶酶体pH值测定提供了新方法，为溶酶体功能活性的检测和研究奠定了基础。