miR-30a-5p通过靶向Runx2基因抑制成骨细胞分化

王如然，黄胜男，曹戬，许华颖，李宏燕，黄浩然，赵杉，王玉红，冯艳华，徐国营，韩兵

1.中国中医科学院广安门医院南区 a.外科，b.药剂科，c.中心实验室，d.院感科，北京 102618；2.北京市大兴区西红门医院 外科，北京 100076

骨质疏松症包括绝经后骨质疏松和老年性骨质疏松，主要表现为骨量减少、骨微观结构退变、骨强度下降而脆性增加，容易诱发骨折[1]。因此，骨质疏松症的诊断和预防非常重要。成骨分化对于骨形成是一个十分重要的过程，并受多种因素的调控，比如miRNA[2]。一些miRNA可以通过靶向重要的成骨因子来抑制成骨细胞的分化。例如miR-153通过靶向骨髓间充质干细胞中的BMPR2来减弱成骨细胞的分化[3]；miR-488通过靶向Runx2负调控补骨脂素诱导的骨髓间充质干细胞成骨分化[4]。因此，对miRNA的研究有助于进一步了解骨质疏松症的病理机制。

RUNT相关转录因子2（RUNT-related transcription factor 2，Runx2）是RUNX家族成员，是与成骨细胞分化相关的关键调节因子，也是正常骨骼发育和成骨过程中必不可少的转录因子[5]。miR-30a-5p在成骨细胞分化中的调节作用还未有报道，其机制尚不清楚。在本研究中，我们检测了miR-30a-5p与成骨细胞分化标志物胶原Ⅰ、骨钙素（osteocalcin，OCN）、骨桥蛋白（osteopontin，OPN）和碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性的关系，进一步探讨miR-30a-5p在成骨细胞分化中的调节作用。

1 材料与方法

1.1 材料

9周龄雌性野生型SD大鼠购自唯尚立德科技有限公司；SD大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）购自赛业生物科学公司；miR-30a-5p模拟物和抑制剂（mimics/inhibitor）及miRNA阴性对照购自百奥迈科生物技术有限公司；Runx2过表达质粒pcDNA3.1-Runx2购自Genearray Biotechnology公司；pMIR报告载体购自优宝生物科技有限公司；DMEM培养基、1%胎牛血清购自赛默飞公司；LipofectAMINE 2000转染试剂盒、TRIzol试剂购自Invitrogen公司；PrimeScript RT试剂盒、MutanBEST试剂盒购自TaKaRa公司；ALP活性检测试剂盒购自北京绿源博德生物科技有限公司；萤光素酶检测试剂盒购自Beyotime Biotechnology公司；PDVF膜购自Millipore公司；Runx2抗体、GAPDH抗体和HRP标记的羊抗兔二抗均购自Abcam公司；化学发光液和凝胶成像仪购自BioRad公司；4%多聚甲醛购自上海润捷公司；茜素红S染色液购自Solarbio公司；miRNA测序由北京基石生命科技有限公司完成。

1.2 大鼠模型建立与分组

将9只9周龄雌性野生型SD大鼠分成雌激素组、骨质疏松模型组及假手术组，每组3只。雌激素组和模型组大鼠均手术切除卵巢，并分别用戊酸雌二醇或生理盐水灌胃，1/d，处理12周；假手术组切除卵巢附近部分脂肪，生理盐水灌胃，1/d，处理12周。取大鼠骨组织测序。检测大鼠血液中ALP和抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）水平，当血清ALP水平超过 147.25±56.29 IU/mL，TRAP水平超过 24.50±1.16 IU/mL，大鼠骨质疏松模型合格。

1.3 差异miRNA表达检测

取大鼠骨组织，液氮冻存，交由北京基石生命科技有限公司进行miRNA测序分析，骨质疏松大鼠模型组与雌激素组和假手术组对比，分析miRNA表达差异。

1.4 成骨诱导

将 BMSCs于 37℃、5%CO2培养箱中培养，每2～3 d换液，细胞融合度达60%～80%时用0.25%Trypsin-EDTA消化传代；收集细胞，按5×103/cm2的密度接种在预先用明胶包被的六孔板中，每孔含培养基2 mL，37℃、5%CO2培养箱中培养；待细胞融合度达到60%～70%开始诱导，小心弃去培养基，并小心沿壁加入37℃预热的成骨诱导分化培养基；每隔3 d更换成骨诱导分化培养基（175 mL培养基，10%胎牛血清，1%谷氨酰胺，1%青霉素-链霉素，0.2%抗坏血酸，1% β-甘油磷酸钠和0.01%地塞米松），直至诱导出现大量矿化结节。

1.5 细胞转染

将2×106BMSCs接种到6孔板中，培养至60%～80%融合；用LipofectAMINE 2000转染试剂盒对细胞进行单独转染，或者共转染miR-NC（20 pmol）、miR-30a-5p模拟物（20 pmol）、miR-30a-5p抑制剂（50 pmol）及pcDNA3.1-Runx2质粒（4 μg）。

1.6 荧光定量PCR

用TRIzol试剂分离提取总RNA，用Prime-ScriptRT试剂盒将RNA逆转录为cDNA，用SYBR Green引物进行定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR），GAPDH和U6分别作为 mRNA和miRNA的标准化内参，以2-ΔΔCt计算相对表达量。Runx2正向引物为5'-TCTAGGAACCTATAGGCCC TTT-3'，反向引物为5'-TGGACGGTCTTATCTTTA CA-3'；OCN正向引物为5'-CGCCGCCGAAACTA ACTC-3'，反 向 引 物 为 5'-CTAGAGTGTCCGAAT TATA-3'；OPN正向引物为5'-ATGGTATAGGGAA GCGGCAACAA-3'，反向引物为5'-CGTGCAGTGG CGCTTATCT-3'；胶原Ⅰ正向引物为5'-AGAATC CGGTTCAGGGA-3'，反向引物为5'-CTTATAGGG TGCCTTCGC-3'；GAPDH正向引物为5'-CGCTCT CTGCTCCTCCTGTTC-3'，反向引物为5'-ATCCGT TGACTCCGACCTTCAC-3'；miR-30a-5p 正 向 引 物为 5'-AAAGTGGACATTTGTAGAGA-3'，反向引物为 5'-CAGGTACAGACGGATATCTTGC-3'；U6 正向引物为 5'-GCTTCGGCCACATATACTTTAAT-3'，反向引物为5'-CGCATCGCAGAATTTGTCTCAT-3'。

1.7 ALP活性检测

将miR-NC、miR-30a-5p模拟物、miR-30a-5p模拟物+OE-Runx2转染的成骨细胞分别接种到6孔板，每孔5×105细胞；细胞黏附于板底后，用成骨分化培养基代替原培养基；细胞在分化培养基中培养12 d，每3 d更换一次培养基；用ALP试剂盒检测细胞的ALP活性；细胞洗涤后，缓冲液重悬，用超声波在冰上处理2次，每次30 s；将细胞以13 000 r/min离心10 min，去除不溶性物质，收集上清液，用对氮苯磷酸二钠法检测ALP活性；用BCA试剂测定总蛋白浓度。

1.8 萤光素酶报告基因检测

1.9 蛋白质表达分析

从细胞中提取总蛋白。每个胶孔内加入等量总蛋白，用10%SDS-PAGE分离，随后将胶上蛋白质转移到PDVF膜上，用5%的脱脂牛奶将膜封闭1 h。将Runx2和GAPDH一抗于4℃孵育过夜，PBST洗涤4次，用辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育2 h，TBST洗涤5次，用增强化学发光法测定其特异性蛋白水平，凝胶成像仪成像。

1.10 茜素红染色

去除培养板中的培养基，用PBS清洗细胞样本2次，用4%多聚甲醛固定细胞10 min；弃去固定液，用PBS清洗细胞样本3次，加入茜素红S染色液染色20～30 min；吸去染色液，用PBS清洗5次，显微镜下观察钙沉积情况并拍照。

1.11 统计学分析

应用SPSS 20.0进行统计学分析，计量数据以x±s表示，2组独立组间采用t检验，多组间采用单因素方差分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 miRNA差异表达分析

miRNA测序结果显示，与假手术组和雌激素组相比，骨质疏松模型组分别有65种和38种miRNA表达上调。在这2组差异miRNA集合中有35种共同的miRNA（图1），其中表达差异排前5的miRNA分别是rno-miR-30a-5p、rno-miR-199a-3p、rno-miR-708-5p、rno-miR-30d-5p及rno-miR-708-3p，而rno-miR-30a-5p又是差异最为显著的（表1）。因此，后续实验选择rno-miR-30a-5p来探讨其对大鼠成骨分化的影响。

2.2 miR-30a-5p在组织中的表达

检测结果显示，miR-30a-5p在模型组中的表达含量最高，明显高于在雌激素组和假手术组中的表达水平，且雌激素组和假手术组中的miR-30a-5p表达水平间没有显著差别。该结果与测序分析结果一致，相对于其他2组，miR-30a-5p在模型组中表达上调。

图1 对比假手术组、雌激素组，模型组上调miRNA的韦恩图

表1 35种上调miRNA中排名前5的miRNA

2.3 miR-30a-5p靶向调控Runx2的表达

通过TargetScan、miRanda和microT综合检测Runx2 3'UTR含有miR-30a-5p潜在结合位点（图3A）。双萤光素酶报告基因检测结果显示miR-30a-5p模拟物显著降低了野生型组萤光素酶活性，而对突变组萤光素酶活性基本没有影响（图3B）。在BMSCs中，miR-30a-5p过表达抑制了Runx2的mRNA和蛋白表达（图3C、D）。以上结果揭示，miR-30a-5p靶向抑制了Runx2的表达。

2.4 Runx2过表达部分缓解miR-30a-5p对成骨细胞分化的抑制作用

为了进一步探究miR-30a-5p/Runx2对成骨细胞分化的影响，用miR-30a-5p模拟物、miR-30a-5p模拟物+pcDNA3.1-Runx2转染大鼠BMSCs，诱导分化。检测结果表明，miR-30a-5p抑制了大鼠成骨钙矿物沉积（图4A），抑制成骨标记蛋白OCN、OPN和胶原Ⅰ的表达（图4C、D），降低ALP活性（图4B）；而同时过表达Runx2后，OCN、OPN和胶原Ⅰ的表达升高，ALP活性增加，Runx2过表达部分缓解miR-30a-5p对成骨细胞分化的抑制作用。以上结果提示miR-30a-5p通过靶向调控Runx2影响成骨细胞分化。

3 讨论

我们通过切除大鼠体内双侧卵巢，降低大鼠体内雌激素分泌水平，构建了骨质疏松大鼠模型，该模型引起的骨质疏松与人类女性绝经后骨质疏松相近，也是FDA和WTO推荐的研究绝经后骨质疏松症的模型[6]。

图2 miR-30a-5p在各组大鼠骨组织中的表达差异

图3 miR-30a-5p靶向调控Runx2的表达

图4 Runx2过表达部分缓解miR-30a-5p对成骨细胞分化的抑制作用

miRNA是一类内生的极其丰富的非编码RNA，几乎参与所有的信号调节通路，与细胞增殖和成骨分化密切相关，可以靶向调控成骨分化途径中关键调节因子和受体的表达，从而影响成骨分化。例如，miR-23a-3p通过靶向调控PGC-1α，影响WNT/βcatenin信号通路，抑制成骨细胞分化与增殖[7]；miR-135a-5p通过靶向Runx2调控成骨分化，参与骨质疏松症的进展[8]；抑制miR-451a可加速骨质疏松症中成骨分化，并通过Bmp6信号途径抑制骨丢失[9]；miR-128通过下调SIRT6的表达抑制骨质疏松症的成骨分化[10]。然而，一些miRNA也扮演着促进成骨分化的角色，如miR-29a通过下调DKK-1表达和激活Wnt/β-catenin信号通路促进成骨细胞增殖[11]；miR-135-5p通过靶向MC3T3-E1细胞中的HIF1AN促进成骨细胞分化[12]。为了探究miRNA在绝经后骨质疏松中的作用机制，本研究通过对模型组、假手术组和雌激素组骨组织进行miRNA测序，并分析差异表达发现，与模型组相比，假手术组和雌激素组有35种相同的miRNA下调表达，具有很好的一致性。在本研究中我们选取了最具差异性而以往较少报道的miR-30a-5p进行深入分析，通过双萤光素酶报告基因验证发现miR-30a-5p靶向调控抑制Runx2的表达，进一步研究miR-30a-5p和Runx2的作用关系发现，miR-30a-5p过表达抑制了成骨标记蛋白OCN、OPN和胶原Ⅰ的表达，并使成骨细胞ALP活性降低；而过表达Runx2缓解了miR-30a-5p对成骨标记蛋白的抑制，促进成骨细胞分化。因此，miR-30a-5p通过靶向调控Runx2抑制大鼠成骨分化。

Runx2含有Runt DNA结合位点，可以结合特定的DNA序列，调节众多基因表达，进而影响成骨细胞的发育[5]。它还与许多蛋白质功能相关，如TGF-β和BMP-2[13]。此外，它通过与共调节蛋白和染色质重塑因子相互作用，在间充质干细胞、成骨细胞和前软骨细胞中调节成骨细胞分化特异性基因[5,14]。据报道，Runx2调节多种成骨细胞分化相关标记物，如OCN、OPN和胶原Ⅰ[15-17]。本研究中miR-30a-5p靶向抑制Runx2的表达，进而影响到OCN、OPN和胶原Ⅰ的表达。但miRNA向来具有多靶标多功能的性质，miR-30a-5p在骨质疏松症中的调节功能可能并不是靶向Runx2那样简单，可能联合其他miRNA涉及更复杂的调控网络，需要进一步深入研究。

综上，miR-30a-5p在骨质疏松大鼠骨组织中表达上调，并能够靶向抑制Runx2的表达，从而抑制成骨细胞形成，这为骨质疏松症的诊断提供了新的潜在生物标志物。