人磷酸葡萄糖变位酶5对肝癌细胞生长和迁移的影响

冉芳，施亚娇，罗沙柳，刘婕，张亚楠，丁丽华，叶棋浓

1.贵州大学 医学院，贵州 贵阳 550025；2.军事医学研究院 生物工程研究所，北京 100850

磷酸葡萄糖变位酶5（phosphoglucomutase 5，PGM5）又称针蛋白（aciculin）或磷酸葡萄糖变位酶相关蛋白（phosphoglucomutase-related protein，PGM-RP），是一种含有567个氨基酸残基的蛋白，属于磷酸葡萄糖变位酶（phosphoglucomutase，PGM）家族，是葡萄糖代谢及糖原代谢过程中的关键酶，可以催化葡萄糖-1-磷酸（G-1-P）和葡萄糖-6-磷酸（G-6-P）的双向转化。一方面，PGM5催化糖原分解代谢产生的G-1-P转化为糖酵解过程的第一个中间产物G-6-P；另一方面，PGM5也促进G-6-P转化为G-1-P，生成合成尿苷二磷酸葡萄糖的底物，该底物是合成多种细胞成分（如糖蛋白）所必需的[1]。1994年，PGM5从人子宫平滑肌中被分离出来，因其氨基酸序列、结构及免疫学特性与PGM1高度相似，因此认为其可能是PGM家族的新成员[2]。1995年Edwards等利用32P标记的PGM1 cDNA的特定基因组文库探针发现了一个与PGM1高度同源的序列，又与其他PGM家族成员有明显区别，因此将其正式命名为PGM5[3]，并发现其定位于人类9号染色体（9q21.11）着丝点区域。

PGM5在细胞中分布于正常骨骼肌纤维细胞外周，细胞与细胞、细胞与基质的连接处[2,4]；在组织中，主要在肌肉组织中集中表达，如平滑肌、骨骼肌和心肌等[5]。过去的20年里，由于PGM5特殊的分布，关于PGM5的研究主要聚焦于其在肌肉组织中的作用。PGM5分布在细胞与细胞、细胞与基质之间，参与介导或调节细胞粘附[4-5]；它与肌营养不良蛋白和抗肌萎缩蛋白相关蛋白相互作用[4,6-8]，在细胞骨架维护中发挥作用；PGM5是细丝蛋白C、Xin-肌动蛋白结合重复蛋白B的结合伙伴，细丝蛋白C与PGM5的N端结合，而Xin-肌动蛋白结合重复蛋白B与PGM5的C端相互作用，二者竞争结合，参与肌原纤维的形成、维持和重塑[9]。也有研究发现它的染色体融合位点离端粒位置很近，可能会影响端粒的功能[10-11]。对PGM5在肿瘤中的表达及作用的研究较少，近年才有研究发现PGM5与肿瘤的发生发展有关。对肿瘤基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库的临床样本分析发现，PGM5在肝癌[12]、结直肠癌[13]中表达下调，与患者预后不良有关；PGM5抑制结直肠癌的生长、迁移和侵袭[13]。但PGM5在肝癌细胞系中的生物学功能未见报道。本研究中，我们拟构建人PGM5基因的真核表达载体，探讨PGM5对肝癌细胞生长、迁移的影响，为进一步研究PGM5在癌症发生发展中的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

人胚肾293T细胞、肝癌HepG2细胞、pcDNA3.0-Flag载体、人乳腺文库（本实验室保存）；限制性内切酶、PCR试剂、DNA连接酶（TaKaRa公司）；质粒提取试剂盒（Promega公司）；胶回收和PCR回收试剂盒（康为世纪生物科技有限公司）；转染试剂VigoFect（威格拉斯生物技术有限公司）；DMEM培养基和胎牛血清（Gibco公司）；辣根过氧化物酶偶联的Flag抗体（Sigma公司），辣根过氧化物酶偶联的β-actin（SantaCruz公司）；大肠杆菌DH5α感受态细胞购买、引物合成及质粒测序（北京博迈德生物技术有限责任公司）。

1.2 pcDNA3.0-Flag-PGM5重组质粒的构建

根据NCBI网站PGM5的编码序列设计并合成上游引物（5'-GGGGTACCATGGAGGGGAGCCC CATCCCGGTGCT-3'）和下游引物（5'-GCTCTAGA TCAGGTGATGACAGTGGGTCCCCTCCGG-3'），上、下游引物5'端分别携带KpnⅠ和XbaⅠ酶切位点。以人乳腺文库为模板扩增PGM5基因（95℃预变性5 min，95℃变性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸2 min，30个循环，72℃再延伸 5 min），PCR产物用胶回收试剂盒回收，回收的PCR产物和载体pcDNA3.0-Flag分别经KpnⅠ和XbaⅠ双酶切，4 h后回收酶切目的片段和载体，将二者用T4DNA连接酶于16℃连接4 h，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含氨苄西林的LB琼脂板，培养16 h后挑取部分菌落进行菌液PCR，选取阳性克隆菌液转入含氨苄西林的LB液体培养基中，37℃、200 r/min摇床培养12 h，提取质粒，双酶切鉴定，阳性克隆送公司测序。

1.3 转染293T细胞

接种适量293T细胞于6孔板中，至转染时细胞密度40%～60%为宜，培养24 h，转染时提前1 h换液。按照VigoFect转染试剂说明，将空载体和pcDNA3.0-Flag-PGM5质粒分别转染293T细胞。取总量 4 μg的质粒加入 NaCl补足至 100 μL 混匀，再将 2 μL VigoFect试剂与 98 μL NaCl混匀，分别静置5 min，将两者混合制成转染工作液，室温静置15 min，加入293T细胞中，轻轻混匀培养液，37℃、5%CO2常规培养，4～6 h后换液，24 h后收取细胞。

1.4 Western印迹

收集细胞沉淀，加入等量细胞裂解液混匀，冰上裂解30 min，再加入等量2×SDS上样缓冲液，沸水煮样15 min，12 000 r/min离心5 min，取上清液进行SDS-PAGE，电泳结束后，电转移至硝酸纤维素膜上，用5%脱脂奶粉封闭1 h，加入用5%脱脂奶粉以1∶3000稀释的Flag-HRP和β-actin-HRP抗体，室温孵育2 h，TBST洗膜3次，5 min/次，化学发光法显色45 s，压片显影。

1.5 CCK8细胞生长曲线

将空载体和pcDNA3.0-Flag-PGM5分别转染HepG2细胞，培养 24 h后，将细胞以3×103/孔的密度接种于96孔板，每组设3个平行孔。每天同一时间点向各孔加入含10%CCK8试剂的DMEM，37℃、5%CO2培养1 h，取出后用酶联免疫检测仪测定D450nm值。

1.6 细胞划痕实验

接种细胞于6孔板，将空载体和pcDNA3.0-Flag-PGM5分别转染HepG2细胞，培养24 h后，每组用小枪头在融合的单层细胞上划3条直线，PBS洗细胞3次，去除死细胞，换成新鲜的低血清培养基，在划痕处分别选上、中、下三点在显微镜下拍照，记录初始位置，24 h后在初始位置再次拍照。用ImageJ软件计算划痕愈合面积。

1.7 数据分析

采用SPSS 22.0和GraphPad Prism 7.0软件进行统计分析。2组之间数据比较采用非配对独立t检验，不同时间点PGM5对肝癌细胞生长的影响用重复测量资料方差分析（ANOVA）。所有实验均独立重复3次，数据以x±s表示，P＜0.05被认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 pcDNA3.0-Flag-PGM5过表达载体的构建与鉴定

以人乳腺文库为模板扩增PGM5基因，获得约1704 bp的目的片段（图1），与预期大小一致。目的片段酶切后插入pcDNA3.0-Flag载体，构成重组质粒。选取2个菌液PCR鉴定为阳性的克隆，提取质粒进行双酶切鉴定，在1500～2000 bp处可见特异性条带，而空载体则无此条带，初步证明其为阳性克隆（图2A）。将酶切鉴定的阳性克隆测序，测序结果表明插入片段序列与人PGM5基因的编码序列相同（图2B，显示部分测序结果）。

2.2 验证pcDNA3.0-Flag-PGM5介导的PGM5的表达

分别将空载体和pcDNA3.0-Flag-PGM5质粒转染293T细胞，24 h后收取细胞蛋白，Western印迹检测其表达情况。结果显示，过表达组在相对分子质量60×103的位置可见特异性条带，而对照组则没有此条带，表明pcDNA3.0-Flag-PGM5能在细胞中介导PGM5表达（图3）。

2.3 pcDNA3.0-Flag-PGM5对肝癌细胞生长的影响

图1 PCR扩增PGM5的编码序列

图2 pcDNA3.0-Flag-PGM5质粒鉴定

为了探究PGM5对肝癌细胞生长的影响，分别将空载体和pcDNA3.0-Flag-PGM5质粒转染HepG2细胞，培养24 h后收取一部分细胞进行Western印迹，检测PGM5的表达；另一部分细胞接种于96孔板，待细胞贴壁后，连续6 d于同一时间用CCK8试剂盒检测PGM5表达对细胞生长的影响。结果见图4，与对照组相比，PGM5过表达十分显著地抑制了HepG2细胞的生长。

2.4 pcDNA3.0-Flag-PGM5对肝癌细胞迁移的影响

采用细胞划痕实验研究PGM5对肝癌细胞迁移的影响，设置对照组、PGM5过量表达组，划痕24 h后测量迁移面积。由图5可知，在HepG2细胞中，与对照组相比，PGM5过表达组划痕愈合面积明显较小，表明PGM5抑制了肝癌细胞的迁移。

图3 pcDNA3.0-Flag-PGM5表达鉴定

图4 PGM5对肝癌细胞生长的影响

3 讨论

最初对于PGM5的研究主要集中于其在肌肉组织中的作用。PGM5在肌膜和肌腱交界处集中表达，参与肌原纤维的形成、维持和转换[4,9]，PGM5是肌营养不良蛋白的结合伙伴，它与肌营养不良蛋白的N端和C端结合[7]，在细胞黏附连接和细胞骨架维护中发挥作用[6,14]。随着对肿瘤研究的逐渐深入，研究者才逐步发现PGM5在肿瘤的发生发展中可能发挥着重要作用。有研究发现透明细胞肾细胞癌中PGM5反义RNA1（PGM5-AS1）表达下调[15]。有学者对TCGA数据库的肝癌临床样本进行分析，发现肝癌组织中PGM5表达低于癌旁正常肝组织，与晚期组织学类型、组织学分级、分期、T分级密切相关[12]，且与生存率和总生存期呈正相关[12-13]，表明PGM5可以作为一个独立的预后因素。在功能上，PGM5的上调可抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭，而PGM5的下调则发挥相反的作用[13]，提示PGM5是结直肠癌新的肿瘤抑制因子。但PGM5对肝癌细胞生物学功能的影响未见报道，因此我们进一步探究了PGM5对肝癌细胞生长、迁移功能的影响。我们的研究表明，PGM5上调可抑制肝癌细胞的增殖和迁移，提示其是肝癌细胞新的肿瘤抑制因子，与TCGA肝癌临床意义分析结果一致。

图5 PGM5对肝癌细胞迁移的影响

综上所述，我们构建了PGM5表达载体，并发现PGM5具有作为肝癌诊断和预后生物标志物的潜力，同时提示其可能在某些肿瘤中扮演肿瘤抑制因子的作用，为进一步研究其在肿瘤发生、发展、转移机制等方面的作用提供了理论基础。