不同品种鲨鱼肝脂质组成特征分析

杨思静,刘小芳,刘建志,冷凯良,2,邵绪卿

(1.中国水产科学研究院黄海水产研究所,农业农村部极地渔业开发重点实验室,山东青岛 266071;2.青岛海洋科学与技术试点国家实验室,海洋药物与生物制品功能实验室,山东青岛 266200;3.中国海洋大学食品科学与工程学院,山东青岛 266003;4.山东信诺检测技术有限公司,山东青岛 266101)

鲨鱼属于脊索动物门、软骨鱼纲,共分成8目22科465种,其中,真鲨科种类最多,角鲨科次之,主要分布于热带、亚热带海域,分布于我国黄海、东海、南海等海域[1]。针对鲨鱼捕捞业,联合国粮农组织(FAO)1999年签署了IPOA-Shark指导方针,鲨鱼捕捞业应以可持续发展为基础来进行管理,以便可以提供持续的鲨鱼相关食品、就业和收入来源[2];区域渔业管理组织(RFMO)中,大西洋金枪鱼国际养护委员会(ICCAT)和海洋勘探国际委员会(ICES)已经成功开发鲨鱼数据库并且应用于鲨鱼捕捞业中[3]。目前鲨鱼的加工利用集中于鱼鳍、鱼肉和鱼皮加工,头部和肝脏等部位常被作为加工副产物而丢弃,造成资源浪费和环境污染[4]。提高鲨鱼肝脏等加工副产物的利用率,是目前行业关注与亟待解决的关键问题。

鲨鱼肝脏中含有丰富的脂类物质,具有较好的开发利用价值,是提升鲨鱼资源利用度和加工产业产品附加值的重要突破点。鲨鱼肝脏中,n-3系列多不饱和脂肪酸,特别是EPA和DHA含量丰富,二者在降低胆固醇含量和促进脑神经发育中发挥重要作用[5]。鲨鱼肝中还含有丰富的角鲨烯和烷氧基甘油。角鲨烯不仅可以作为保湿剂应用于医药、化妆品行业,还具有防止氧化降解、提高机体自身免疫、降低心血管疾病等作用[6];烷氧基甘油可用于糖尿病、哮喘、抗炎、提高免疫力、抗肿瘤等医用领域[7]。然而,受自身生活习性、储能方式等的影响,不同品种鲨鱼肝脏脂质组成和营养价值存在较大差异[8],但目前鲜有文献对此进行系统研究报道,仅少数研究关注了个别品种鲨鱼肝脂肪酸组成或角鲨烯含量[9-11]。因此,应对不同品种鲨鱼肝的脂质组成与差异对比继续研究和阐释。

本研究对深海长尾鲨(Alopiassuperciliosus)、大青鲨(Prionaceglauca)、路氏双髻鲨(Sphyrnalewini)、镰状真鲨(Carcharhinusfalciformis)的鱼肝脂质进行了系统的检测,对比分析了不同品种鲨鱼肝在脂质组成、脂肪酸组成、角鲨烯含量以及烷氧基甘油含量等方面的差异,旨在为鲨鱼肝脂质资源的高效精准利用提供科学指导。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鲨鱼肝 深海长尾鲨(A.superciliosus)、大青鲨(P.glauca)、路氏双髻鲨(S.lewini)、镰状真鲨(C.falciformis)四种鲨鱼鱼肝,由福建宏东渔业股份有限公司提供,真空包装低温运至实验室,于-20 ℃冰箱贮存备用。四种鲨鱼的捕捞位点和鱼体基础数据见表1;37种脂肪酸甲酯(纯度≥95%)、胆固醇(纯度≥99%)、角鲨烯(纯度≥98%)、十八烷氧基甘油(纯度≥98%)等标准品 美国Sigma公司;甘油三酯试剂盒、胆固醇试剂盒 北京中生北控生物科技有限公司;氯仿、甲醇、正己烷、正庚烷、无水乙醇、乙酸酐等分析纯试剂 上海国药集团化学试剂有限公司。

表1 四种鲨鱼的捕捞位点和鱼体基础数据(n=3)Table 1 Fishing sites and basic body datas of the four kinds of sharks(n=3)

SP-752紫外分光光度计 上海光谱仪器有限公司;G1530A气相色谱仪、SP-2560(100 m×0.25 mm×0.20 μm)毛细管柱、INNOWax毛细管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)、DB-5(30 m×0.25 mm×0.25 μm)毛细管柱 美国Agilent公司。

1.2 实验方法

1.2.1 营养成分含量的测定 蛋白质含量测定按照CB 5009.5-2016分光光度法规定执行;水分含量测定按照GB 5009.3-2010直接干燥法规定执行;总脂含量测定按照GB 5009.6-2016 索氏抽提法规定执行;灰分含量测定按照GB 5009.4-2010高温灼烧法规定执行。

1.2.2 脂质组成的测定

1.2.2.1 鱼肝总脂质的提取 采用Folch法[12]提取鲨鱼肝脏总脂质。样品匀浆后取适量采用氯仿-甲醇溶液(2/1,V/V)室温振荡提取4 h,过滤收集提取液,加入一定体积0.88%氯化钠溶液,充分混匀后静置过夜分层,收集下层氯仿层,旋蒸脱溶后采用氯仿-甲醇溶液(2/1,V/V)复溶,即得鲨鱼肝脏总脂提取液。

1.2.2.2 甘油酯含量的测定 适量总脂提取液氮气吹干,以50 μL异丙醇/Triton X-100溶液(9∶1;V/m)复溶,以50 μL异丙醇做空白对照,按试剂盒说明测定总脂中甘油酯含量。

1.2.2.3 磷脂含量的测定 按照GB/T 5537-2008钼蓝比色法规定执行。

1.2.2.4 游离脂肪酸含量的测定 适量总脂提取液氮气吹干,用3 mL正庚烷溶解,振荡1 min后加入1 mL脂肪酸显色剂(5%醋酸铜溶液,用吡啶调pH至6.1),振荡2 min,静置10 min后取上层有机相于715 nm处测OD值,以油酸为对照品绘制标准曲线(Y=0.1178X+0.0019,R2=0.9985),计算总脂中游离脂肪酸的含量。

1.2.2.5 胆固醇含量的测定 参照文献[13]方法,采用Agilent SP-2560气相色谱柱进行测定;以氮气为载气,进样温度和检测器温度分别为280和290 ℃;升温程序:起始温度200 ℃,以30 ℃/min上升至290 ℃,保持9 min。外标法定量。

1.2.3 脂肪酸组成的测定 样品前处理:参照文献[14]方法,取适量总脂提取液氮气吹干,加入10%硫酸甲醇溶液,充入氮气,密封,于90 ℃甲酯化反应30 min,冷却至室温,以正己烷振荡提取,静置分层,进气相色谱分析。

气相色谱条件:采用Agilent INNOWax毛细管柱分析测定;进样口温度240 ℃,分流比20∶1,进样量1 μL;载气为高纯氮气,流速1 mL/min;FID检测器温度250 ℃,氢气流速40 mL/min,空气流速450 mL/min,尾吹气(氮气)流速40 mL/min;升温程序:起始温度170 ℃,以3 ℃/min升温至210 ℃,保持30 min,单个样品分析过程为43.3 min。各脂肪酸含量采用面积归一化定量。

1.2.4 角鲨烯的测定 样品前处理:参照文献[15]方法,取适量总脂提取液经KOH-甲醇溶液皂化后,用正己烷/氯仿=4/1(V/V)萃取三次,合并上层萃取液定容后,进气相色谱分析。

气相色谱检测条件:采用Agilent DB-5毛细管柱进行测定;以氮气为载气,流速30 mL/min,氢气流速为40 mL/min,空气流速为450 mL/min;进样口温度250 ℃,分流比10∶1;升温程序:起始温度为160 ℃,以15 ℃/min升温至220 ℃,保持2 min后,以5 ℃/min升温至300 ℃,保持22 min。

1.2.5 烷氧基甘油的测定 样品前处理:参照文献[16]方法,取适量总脂提取液经KOH乙醇溶液皂化后用正己烷提取,离心后收集上清液,旋转蒸发浓缩至干,加入乙酸酐进行回流酯化,用正己烷定容后进气相色谱分析。

气相色谱检测条件:采用Agilent DB-5毛细管柱进行测定;以氮气为载气,流速30 mL/min,氢气流速为40 mL/min,空气流速为450 mL/min;进样口温度300 ℃,分流比10∶1;升温程序:起始温度为200 ℃,保持1 min后,以20 ℃/min上升至280 ℃,保持10 min。

1.3 数据处理

实验结果以“平均值±标准偏差”表示,每项指标平行测定3次。采用SPSS 20.0软件对数据进行分析,以P<0.05为具有统计学意义的显著性差异。

2 结果与分析

2.1 鲨鱼肝基本营养成分组成分析

四种鲨鱼肝的基本营养组成见表2。由表可知,四种鲨鱼肝的水分含量范围在29.11%±1.27%～70.23%±1.31%,蛋白质含量范围在9.05%±0.66%～21.33%±0.81%,脂肪含量范围在7.20%±0.33%～60.42%±1.89%,灰分含量范围在0.13%±0.02%～1.68%±0.12%。不同品种鲨鱼鱼肝的蛋白质、脂质和灰分含量差异显著(P<0.05)。其中,深海长尾鲨鱼肝的蛋白质含量最高,为21.33%±0.81%,其脂肪含量最低;路氏双髻鲨鱼肝的脂肪含量最高,为60.42%±1.89%,蛋白质含量最低。本研究中的四种鲨鱼肝脂质含量低于突尼斯海域的玲珑星鲨(Mustelusmustelus,64.25%±0.37%)和白斑角鲨(Squalusacanthias,65.98%±0.49%)[17]。不同鲨鱼栖息环境与生活习性不同,蛋白质、脂质等营养物质代谢转化模式存在差异[18],推测这是导致不同品种鲨鱼鱼肝基本营养组成呈现显著性差异的主要原因。

表2 四种鲨鱼肝蛋白质、脂质和灰分和水分含量(n=3)Table 2 Protein,lipid,ash and moisture contents of the four kinds of shark livers(n=3)

表4 四种鲨鱼肝总脂脂肪酸组成(n=3,%)Table 4 Fatty acid compositions of the lipid from the four kinds of shark livers(n=3,%)

续表

2.2 鲨鱼肝脂质组成分析

四种鲨鱼肝脂质组成见表3。由表可知,鲨鱼肝脂质主要由甘油酯、磷脂、游离脂肪酸组成,含量排序为:甘油酯>磷脂>游离脂肪酸>胆固醇。相较于南方乌鲨(Etmopterusgranulosus)[19]以及海参、凡纳滨对虾等其他水产动物[20],鲨鱼肝中甘油酯含量略高,推测与本研究中采用的检测方法有关,鲨鱼肝中存在的二酰基甘油醚也会在脂肪酶的作用下部分水解并参与后续显色反应,进而对甘油酯的准确定量产生一定影响。

表3 四种鲨鱼肝脂质组成(n=3)Table 3 The lipid compositions of the four kinds of shark livers(n=3)

路氏双髻鲨鱼肝磷脂含量最高,占总脂的21.20%±0.18%,其次是大青鲨,占总脂的18.23%±0.24%。四种鲨鱼肝中,深海长尾鲨和路氏双髻鲨的磷脂含量具有显著性差异(P<0.05)。与其他地域和种属的鲨鱼相比,本研究涉及的四种鲨鱼肝磷脂含量大于南方乌鲨(0.7%)[19]、加勒比水域丝鲨(未检测到)、加尼福尼亚水域的鼬鲨(5.1%)以及斯里兰卡西海岸五种鲨鱼肝油磷脂含量(0.4%～2.7%)[21];与其他海产品相比,这四种鲨鱼肝磷脂含量高于牡蛎的14.51%[22],低于海星的73.70%～86.69%[23]以及太平洋真鳕鱼卵的58.7%[24];与陆基食品原料的磷脂含量相比,这四种鲨鱼肝磷脂含量远远大于鸡蛋的3.36%～4.40%和大豆的6.67%[25]。已有研究指出,海洋磷脂在调节机体脂代谢、糖代谢方面具有优于陆基磷脂的生理活性[26-27],因此,磷脂资源的开发利用将是鲨鱼肝资源高值化利用的重要方向。

四种鲨鱼肝油中胆固醇含量在0.73%±0.12%～4.72%±0.45%之间,与已报道的斯里兰卡西海岸五种鲨鱼肝油中胆固醇含量(2.9%～12.7%)[21]基本一致,低于鲣鱼肝油[28]和鮟鱇鱼肝油[29]。在人体中,胆固醇主要来自于自身的合成,只有少量需要从食物中补充,即可满足身体需要。过高的胆固醇会增加罹患心脑血管疾病以及肾脏疾病的风险。在开发鲨鱼肝脂质资源时,应注意采取必要的工艺控制终端产品中胆固醇的含量,可以考虑在加工工艺中采用超临界萃取法、β-环状糊精包合法进行脱除[30]。

2.3 鲨鱼肝脂肪酸组成分析

四种鲨鱼肝总脂脂肪酸组成见表4。由表4可知,四种鲨鱼肝总脂共检测出30种脂肪酸。对于饱和脂肪酸,四种鲨鱼肝油中主要以C16∶0、C18∶0为主;镰状真鲨鱼肝总脂的饱和脂肪酸含量最高,为45.03%。对于单不饱和脂肪酸,四种鲨鱼肝油主要以C16∶1、C18∶1n9c为主;路氏双髻鲨鱼肝总脂的单不饱和脂肪酸含量最高,为39.0%。对于多不饱和脂肪酸,四种鲨鱼肝油主要以C20∶4n6、C20∶5n3(EPA)和C22∶6n3(DHA)为主;深海长尾鲨鱼肝总脂的多不饱和脂肪酸含量最高,为46.78%。四种鲨鱼肝总脂多不饱和脂肪酸含量范围为27.29%～46.78%。与其他种属的鲨鱼肝油相比,本研究中涉及的四种鲨鱼肝油的多不饱和脂肪酸含量均高于太平洋睡鲨(Somniosuspacificus)肝油中的13.3%、喙吻田氏鲨(Deaniacalcea)肝油中的7.2%[19]。本研究中涉及的四种鲨鱼肝总脂中n-3系列多不饱和脂肪酸,特别是EPA+DHA含量丰富,与其他种属的鲨鱼相比,EPA+DHA含量均远高于太平洋睡鲨肝油的7.7%和葡萄牙角鲨(Centroscymnusplunkeit)肝油的1.2%[19]。这四种鲨鱼肝油中,深海长尾鲨鱼肝总脂脂肪酸中EPA+DHA含量最高,为37.27%,EPA和DHA含量分别为4.40%±0.30%和32.87%±0.73%,其次为大青鲨,EPA+DHA总量为33.64%,EPA和DHA含量分别为6.75%±0.59%和26.89%±0.81%,均高于鳐鱼肝油的2.51%和20.9%以及鮟鱇鱼肝油的3.95%和12.5%[29]。深海长尾鲨、大青鲨和镰状真鲨的EPA+DHA总量均高于已有报道的玲珑星鲨(Mustelusmustelus)(26.90%)和白斑角鲨(Squalusacanthias)(19.54%)[17]。另外,不同品种鲨鱼鱼肝总脂中n-3 PUFA/n-6 PUFA比值存在差异,比值范围为5.16～13.48,推测可作为鲨鱼肝原料来源鉴别的有效指标。

2.4 鲨鱼肝角鲨烯与烷氧基甘油含量分析

四种鲨鱼肝油角鲨烯和烷氧基甘油含量分析结果见表5。四种鲨鱼肝油中角鲨烯含量差异显著(P<0.05),范围为(59.52±1.96)～(330.51±4.96) mg/kg,其中路氏双髻鲨含量最高。已有报道指出,白斑角鲨(S.acanthias)和高鳍白眼鲛(Carcharhinusplumbeus)肝油中几乎没有检测到角鲨烯,光尾鲨(pristurus)肝油的角鲨烯含量小于1%,而黑鲛(Dalatiaslicha)肝油中角鲨烯含量则高达79%[31]。不同种类鲨鱼肝油中角鲨烯含量差异较大,推测与不同种类鲨鱼的栖息海域以及食物链密切相关。

表5 四种鲨鱼肝角鲨烯与烷氧基甘油含量(n=3)Table 5 Squalene and alkoxyglycerol contents ofthe lipid from the four kinds of shark livers(n=3)

四种鲨鱼肝油中烷氧基甘油含量差异显著(P<0.05),范围为(91.13±4.15)～(207.47±6.50) mg/g,其中路氏双髻鲨含量最高。唐小红[32]测得印度深海鲨鱼肝油中烷氧基甘油平均值为(105.41±3.44) mg/g;王林祥等[33]测得澳洲塔斯玛尼亚湾深海鲨鱼油中总烷氧基甘油含量为274.9 mg/g。鲨鱼肝油中烷氧基甘油主要包括十六烷氧基甘油、十六一烯烷氧基甘油、十八烷氧基甘油、十八一烯烷氧基甘油等形式,因不同结构烷氧基甘油存在功能差异,后续研究可关注解析不同品种鲨鱼肝油中烷氧基甘油的精细组成,为该部分资源的精准利用提供指导。

3 结论

本研究对深海长尾鲨、大青鲨、路氏双髻鲨、镰状真鲨等四种鲨鱼肝的脂质组成进行了系统分析对比,结果显示,鲨鱼肝富含磷脂、n-3系列多不饱和脂肪酸、角鲨烯与烷氧基甘油,营养价值丰富,具有极高的开发利用价值。不同品种鲨鱼肝营养组成,特别是脂质组成各具特征:其中,深海长尾鲨鱼肝中蛋白质含量丰富,为21.33%±0.81%;路氏双髻鲨鱼肝中脂质含量丰富(60.42%±1.89%),其磷脂(21.20%±0.18%)、角鲨烯(330.51±4.96 mg/kg)、烷氧基甘油(207.47±6.50 mg/g)含量均为四种鲨鱼中最高;深海长尾鲨和大青鲨鱼肝油中以EPA、DHA为主的多不饱和脂肪酸含量丰富,分别达到总脂脂肪酸的37.27%和33.64%。鲨鱼肝的营养价值取决于各营养成分的含量、组成以及各营养成分间的交互作用,对鲨鱼鱼肝资源进行开发时应结合鱼肝自身特征进行定向利用。