苜蓿多肽制备工艺优化及其抗氧化活性

李伟民,张莹丽,刘可玉,郑丽娟,魏泉增

(1.许昌学院食品与生物工程学院,河南省食品安全生物标识快检技术重点实验室,河南许昌 461000;2.鄢陵县市场监督管理局,河南鄢陵 461200)

紫花苜蓿在我国各地均有种植[1]。苜蓿鲜草中蛋白含量达5.9%[2],苜蓿干草中蛋白质含量能够达到22%以上,含有的氨基酸种类多样[3]。但大多数直接提取的苜蓿叶蛋白很难被直接利用,且具有很强的抗原性,表现为较低的消化率和生物效价[4],故苜蓿蛋白产业的发展受到一定的阻碍。

苜蓿蛋白经过酶法水解后制备的多肽对人体具有重要作用,多肽是涉及人体内多种细胞功能的重要物质,具有预防心脑血管疾病、促进造血功能、调节内分泌与神经系统[5]等方面疾病。多肽类药物在这些疾病的治疗上具有显著效果[6]。多肽不仅可以提高物质的利用价值,还可赋予物质一定的生物学活性,尤其是在增强抑菌性[7]、免疫性[8]和抗氧化性[9]等方面。

近年来,多肽的制备多选用绿豆[10]、葵花籽[11]、海参[12]、鱼籽[13]等原料,而这些原材料通常价格昂贵或不易获取。而本实验采用苜蓿为原材料,苜蓿易获得,经济价值低,种质资源丰富。对苜蓿多肽的制备方法的研究较少。本研究利用碱性蛋白酶对苜蓿进行酶解制备多肽,可充分利用苜蓿的蛋白资源,开发苜蓿的潜在价值,提高苜蓿的综合利用价值。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

紫花苜蓿、碱性蛋白酶(20万U/g) 食品级,南宁庞博生物工程有限公司;酪蛋白、氢氧化钠、硫酸铜、酒石酸钾钠、盐酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、硫酸亚铁、过氧化氢、三氯乙酸、水杨酸、三羟甲基氨基甲烷 天津市科密欧化工有限公司;无水乙醇、抗坏血酸、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 天津医药化学有限公司;上述试剂 均为分析纯。

FA2014B分析天平、PHS-3C型pH计 上海佑科仪器仪表有限公司;TG16-WS离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司;T6可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;Dk-8D水浴锅 常州普天仪器制造有限公司;DL-1型电炉 中兴伟业仪器有限公司;750t型粉碎机 鹤壁市天冠仪器仪表有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 多肽溶液制备 准确称取一定量的苜蓿粉于反应容器中,依照蛋白酶添加量加入一定量的碱性蛋白酶溶液,调整到预设pH,缓慢搅拌,在一定温度下酶解一定的时间,酶解过程中注意维持酶解系统pH恒定。酶解结束后将酶液迅速置于沸水中灭酶10 min。冷却至室温后4000 r/min离心10 min,收集上清液。

1.2.2 单因素实验 在蛋白酶添加量3000 U/g、酶解温度50 ℃、酶解时间4 h、酶解pH9.0的条件下,分别研究碱性蛋白酶添加量(1000、2000、3000、4000、5000 U/g),酶解温度(40、45、50、55、60 ℃),酶解时间(2、3、4、5、6 h),酶解pH(7.0、8.0、9.0、10.0、11.0)四个因素对溶液中多肽含量的影响。

1.2.3 响应面实验 在单因素实验结果探索最适酶解时间、最适酶解pH、最适酶解温度、最适碱性蛋白添加量的基础上,选取其中的酶解时间、酶解pH、酶解温度作响应面综合分析。采用Design-expert 8.0.6软件中心组合实验进行多肽含量提取最佳工艺。实验方案见表2。

表2 实验因素和水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken test

1.2.4 多肽含量的测定

1.2.4.1 标准曲线绘制 溶液中多肽含量测定方法采用双缩脲法[14]。标准曲线制备方式见表1。在试管中加入一定量的10 mg·mL-1酪蛋白溶液,其中不足1 mL的用蒸馏水补至1 mL,以1.0 mL的蒸馏水为空白,最后向各试管中加入的双缩脲试剂4 mL,充分混匀,室温下反应30 min,然后用721分光光度计在540 nm处测其吸光值,作标准曲线。得到回归方程:y=0.0435x+0.0009,相关系数R2=0.9999。

表1 蛋白标准曲线绘制Table 1 Preparation of protein standard curve

1.2.4.2 多肽浓度测定 将收集到的上清液定容至100 mL,摇匀移取溶液5 mL,加入10%的三氯乙酸溶液5 mL,混匀后放置10 min,4000 r·min-1离心5 min,静置30 min后,取上清液1 mL,并和4 mL双缩脲试剂混合,室温下静置30 min,以蒸馏水为空白,测定吸光度。根据标准曲线关系式,计算多肽浓度。

1.2.5 抗氧化性测定

1.2.5.1 DPPH自由基清除能力的测定 DPPH自由基清除能力的测定参考王惠敏等[15]方法。向2 mL的酶解液中加入0.04 mg/mL的DPPH无水乙醇溶液2 mL,混合均匀,在黑暗环境中反应30 min,用无水乙醇作空白对照,在517 nm下测定其吸光值,VC做标准抗氧化剂(A0)。

式(1)

式中:A0为空白组(DPPH自由基+蒸馏水)吸光度;A1为样品组(2 mL样品溶液+2 mL DPPH溶液)吸光度;A2为空白组(2 mL 95%乙醇溶液+2 mL DPPH溶液)吸光度。

1.2.5.2 羟自由基清除能力的测定 羟自由基清除能力的测定采用Fenton体系,参考龙晓珊等[16]方法。

1.2.5.3 超氧阴离子自由基清除能力的测定 超氧阴离子自由基清除能力的测定参考王俏等[17]的方法。

1.3 数据处理

响应面实验结果利用Design-Expert 8.0.6软件进行分析,建立回归方程并作等高线和三维曲面图,对任意两种因素的交互效应进行分析和评价,得到最优工艺组合。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 蛋白酶添加量对酶解效果的影响 蛋白酶添加量对酶解效果的影响如图1所示。苜蓿在碱性蛋白酶添加量1000 U/g的条件下多肽含量最低,随着蛋白酶添加量增加,水解度不断增大,当碱性蛋白酶添加量达到3000 U/g时,多肽含量最高,随着蛋白酶量继续增加,多肽含量下降。当酶浓度过高时,酶分子间可能相互水解,导致酶解效果下降[18]。

图1 蛋白酶添加量对苜蓿多肽含量的影响Fig.1 Effect of protease dosage on peptide yield of alfalfa

2.1.2 酶解pH对酶解效果的影响 酶解pH对酶解效果的影响如图2所示。在pH为7的条件下所得的多肽含量最小,在pH7.0～9.0范围内,随着pH的增加,酶解液中多肽含量逐步增加,在酶解pH为9.0时多肽含量最大,pH在9.0到11.0的范围内,随着pH的增加,多肽含量逐渐下降。酶解最适pH为9.0。

图2 酶解pH对苜蓿多肽含量的影响Fig.2 Effect of pH on peptide yield of alfalfa

2.1.3 酶解温度对酶解效果的影响 酶解温度对酶解效果的影响如图3所示,溶液中多肽含量呈现先缓慢上升后逐渐下降趋势。在40～50 ℃范围内,溶液中多肽含量随酶解温度的升高逐渐增多。当温度达到50 ℃时,苜蓿多肽含量最高,随后继续增大温度,多肽含量开始下降,当温度达到60 ℃时,苜蓿多肽含量最低,温度偏高或偏低会抑制碱性蛋白酶的活性,温度过高会导致碱性蛋白酶逐渐失活,影响酶解效果,酶解温度应为50 ℃。

图3 酶解温度对苜蓿多肽含量的影响Fig.3 Effect of enzymolysis temperatureon peptide yield of alfalfa

2.1.4 酶解时间对酶解效果的影响 酶解时间对酶解效果的影响如图4所示。在酶解2 h的条件下多肽含量最低,随着酶解时间的增加,多肽含量随之增加,在酶解时间为5 h时多肽含量最大,随着酶解时间继续增加,苜蓿多肽含量下降。这可能是由于随着酶解时间的延长,短链的多肽片段被继续水解为氨基酸[15]。酶解最适时间为5 h。

图4 酶解时间对苜蓿多肽含量的影响Fig.4 Effect of enzymolysis time on peptide yield of alfalfa

2.2 响应面法优化

2.2.1 响应面法实验分析及结果 由四个单因素结果选取其中的酶解时间(A)、酶解pH(B)、酶解温度(C)这三个因素作为参考依据,以多肽含量为指标。进行响应面实验,确定碱性蛋白酶水解制备苜蓿多肽的最佳工艺条件。响应面实验方案及结果见表3。

表3 响应面实验设计及结果Table 3 Design and results ofrespond surface experimental test

表4 回归分析结果Table 4 Analysis results of regression and variance

图5直观反映了不同两因素之间的交互作用对多肽含量的影响,曲面越弯曲,两因素交互作用对多肽含量的影响越显著[19]。酶解pH、酶解时间的图形曲线走势较陡,说明其影响最为显著。两两因子交互作用是否显著也与等高线图形相关,等高线图形呈椭圆形,表明各因子的交互作用显著。由等高线疏密和性状可知,酶解时间和酶解pH、酶解pH和酶解温度的交互作用对酶解液中多肽含量的影响具有显著性,酶解时间和酶解温度对酶解液中多肽含量的影响不显著。

图5 不同两因素之间交互作用对酶解液中多肽含量的影响Fig.5 Effects of the interactions between different two factors on polypeptide content in the enzymatic hydrolysates

2.3 苜蓿蛋白酶解工艺的确定及优化工艺条件验证

经Box-Behnken实验设计,Design-export 8.0.6软件分析得出最优条件为:酶解pH为8.79,时间4.9 h,温度49.95 ℃。此条件下酶解液中多肽含量为4.95 mg·mL-1。将工艺参数酶解时间调整为4.9 h,温度为49.9 ℃,pH为8.79,在此工艺测定的多肽含量为4.94 mg·mL-1。与理论条件下的多肽含量较为接近。可以证明模型可靠,方程能够比较真实的反映各因素对多肽含量影响的实际情况。通过软件建造的模型也能真实直观的反映情况,模型与实际情况贴近吻合,此响应面的数据处理真实有效。

2.4 最优工艺条件下制备的苜蓿多肽抗氧化测试

对最优工艺下制备的苜蓿多肽含量进行测定,结果为4.94 mg·mL-1,稀释后,测定其抗氧化活性,结果如图6所示。1 mg·mL-1浓度下阳性对照VC对DPPH自由基、羟自由基、超氧阴离子自由基的清除率分别为95.69%、91.14%和93.12%。1 mg·mL-1样品对DPPH自由基清除率为61.53%,对羟自由基的清除率可达74.61%,对超氧阴离子自由基的清除能力为72.14%,苜蓿多肽清除自由基的能力低于VC,但苜蓿多肽对三种自由基的清除率均较高,表现出较好的抗氧化能力。

图6 苜蓿多肽清除自由基清除能力Fig.6 Free radicals scavenging activity of alfalfa peptides

3 结论

本实验为利用我国苜蓿蛋白资源,提高苜蓿的附加值,探讨了在单因素基础上,进行响应面实验对苜蓿蛋白酶解工艺进行优化,苜蓿多肽制备的最优条件为加酶量3000 U/g,酶解pH8.79,酶解温度49.9 ℃,酶解时间4.9 h。在此条件下,测得溶液中多肽的含量最高,为4.94 mg·mL-1,与预测值两者之间的相对误差为0.2%。在该条件下,1 mg·mL-1样品对羟自由基和超氧阴离子自由基的清除能力较强,分别为74.61%和72.14%,对DPPH自由基清除能力较弱,为61.53%,苜蓿多肽抗氧化能力低于相同浓度下的VC,但苜蓿多肽对三种自由基均表现出较好的抗氧化能力,说明苜蓿多肽具有良好的抗氧化活性。