鼠李糖乳杆菌LRZB110701的安全性评价及其益生特性初步研究

郑柳青,刘冬梅,张馨月,周钦育,黄燕燕,许喜林

(华南理工大学食品科学与工程学院,广东广州 510640)

近年来,随着人们对健康越来越重视,乳酸菌的益生功能也受到了人们的广泛关注。乳酸菌可以调节人体肠道内菌群结构平衡[1],降胆固醇[2],增强免疫力[3],提高机体内营养因子的吸收和利用率[4]。鼠李糖乳杆菌大量应用于发酵制品工业,是目前研究最广泛和深入的乳酸菌之一。鼠李糖乳杆菌在宿主患急性胃肠炎期间仍能促进肠道菌群的平衡,并能在宿主体内定殖[5]。Kamal等[6]将鼠李糖乳杆菌添加到人工污染样本的酸奶中,可减少致病菌数量甚至完全消除致病菌。

外源益生菌的生长环境与胃肠道环境相差很大,很多益生菌对胃肠道环境不耐受,因此许多学者认为应该从人体自身的胃肠道中筛选有潜在应用价值的益生菌。Bin等[7]从人肠道中筛选出11株乳酸菌并进行菌株的益生性研究,这些菌株大多能较好的耐受胃肠道环境。Junjie等[8]的研究证明人源益生菌和人体肠道菌群之间有着特异选择的关系。阿依米热·毛拉木等[9]从新疆喀什地区的长寿老人肠道中分离筛选出具有较强的耐酸耐胆盐能力的乳酸菌,为人源益生菌的开发利用提供了新的菌种来源。

目前市场上较为著名的益生菌株如BB12、LGG都来源于国外,国内对本土益生菌株开发和利用尚不足。本实验对从广州一月龄婴儿粪便中分离出的乳杆菌进行生理生化特征和生物学鉴定,并对LR-ZB1107-01进行了体外安全性评价,主要包括溶血性实验、抗生素敏感性实验以及动物急性毒性实验。本实验还对其代谢产物的抑菌性、人工胃肠液耐受性、肠道黏附性、疏水性以及自聚性进行了综合评价并与鼠李糖乳杆菌标准菌株ATCC7469进行对比。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

LactobacillusrhamnosusZB1107-01 本课题组从婴儿粪便中筛选获得,于2019年4月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏编号为CGMCC NO. 5172;雌雄各半的健康成年SPF级KM小鼠20只 由广东省医学实验动物中心提供;大肠杆菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003、单增李斯特菌CMCC(B)54002 由华南理工大学食品科学与工程学院食品安全实验室保存;基础MRS培养基、LB培养基 广东环凯生物科技有限公司;葡萄糖、蔗糖、吲哚、过氧化氢 分析纯,广州化学试剂厂;哥伦比亚血琼脂平板 广州卯林试剂有限公司;Caco-2细胞、MEM细胞基础培养基 丰晖生物科技有限公司。

SW-CJ-1FD型超净工作台 苏州华科净化设备有限公司;GI36TW型全自动高压灭菌锅 致微(厦门)仪器有限公司;LHS-80型恒温恒湿培养箱 上海百典仪器设备有限公司;TCS-SP2倒置显微镜 德国Leica公司;3543型CO2恒温培养箱 美国Thermo公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株的鉴定

1.2.1.1 形态学分析 取分离纯化后的单菌落涂片,进行革兰氏染色,在显微镜下观察菌株的形态特征。

1.2.1.2 生理生化特征分析 参照伯杰氏细菌鉴定手册(第 8 版)[10]进行。

1.2.1.3 菌株的分子生物学鉴定 参照参考文献提取DNA[11],取菌悬液1.0 mL,12000 r/min离心1 min,弃上清液,沉淀悬于0.6 mL溶菌酶溶液中,颠倒混匀后置于37 ℃下恒温40 min。用试剂盒提取菌株的基因组DNA;利用模板DNA进行PCR扩增,扩增条件为:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s;55 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min,30个循环;72 ℃延伸5 min。PCR扩增后用凝胶电泳检测PCR产物特异性,切胶回收纯化后PCR产物送广州基迪奥生物技术有限公司进行测序,将测序结果与GenBank中相关菌株的基因组序列进行同源性对比,鉴定菌株。16S rDNA引物及序列如下:27F:AGA GTT TGA TCC TGG TCA;1492R:GGT TAC CTT GTT ACG ACT T。

1.2.2 菌株的安全性评价

1.2.2.1 菌株的溶血性检测 将活化好的LR-ZB1107-01以及质控菌株大肠杆菌用灭菌的接菌环划线接种于哥伦比亚血琼脂平板中,于37 ℃培养48 h,同时做空白试验,观察菌落周围有无溶血圈出现。

1.2.2.2 抗生素敏感性实验 参照张丹青[12]的实验方法,将活化后的鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01菌液均匀涂布在MRS固体培养基表面,将浸泡有四环素(30 μg/片)、红霉素(15 μg/片)、氨苄西林(30 μg/片)、卡那霉素(30 μg/片)的纸片置于已凝固的培养基上,每组抗生素纸片做3个重复,37 ℃培养48 h。观察并测量抗生素纸片周围出现的透明圈。

1.2.2.3 动物经口急性毒理试验 选用18～22 g的健康成年SPF级KM小鼠20只,雌雄各半。将处于生长期的待测菌株用PBS缓冲液将浓度调整至1×108CFU/mL,空腹灌胃一次,每次灌胃容量为20.0 mL/kg体重。灌胃后立即观察其活动表现、体重以及身体状况变化,观察期为14 d。

1.2.3 菌株的益生特性研究

1.2.3.1 抑菌活性 采用牛津杯法来测定LR-ZB1107-01代谢产物的抑菌性,金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、单增李斯特菌作为指示菌株,指示菌(约108CFU/mL)涂布于LB琼脂培养基表面,将无菌牛津杯平行放置于平板中,在牛津杯中加入200 μL 待测样品,缓慢将平板置于37 ℃恒温培养箱中,培养24 h,观察并测量抑菌圈直径大小。用上述相同的方法测定鼠李糖乳杆菌标准菌株ATCC7469的抑菌特性。

1.2.3.2 胃肠液耐受性 参考Strompfovád等[13]的方法,略有修改。活化后的LR-ZB1107-01菌液按照5%(v/v)的接种量,分别接种于pH=2、2.5、3、4的人工模拟胃液中,同时以无菌生理盐水作为空白组,37 ℃培养,在0、1、2、3 h取样,计活菌数(CFU/mL)。菌液按照5%(v/v)的接种量接种于人工肠液中,同时以无菌生理盐水为空白组,37 ℃培养,在0、2、4、6、8 h取样,计活菌数(CFU/mL)。鼠李糖乳杆菌标准菌株ATCC7469在上述相同条件下进行人工模拟胃液、肠液实验。菌落计数方法参考GB 4789.35-2016《食品安全国家标准 食品微生物检验 乳酸菌检验》。

1.2.3.3 肠道黏附性 Caco-2细胞传代培养2～3次后,将细胞浓度调整至2×105个/每孔,传代至24孔板中进行黏附实验。调整LR-ZB1107-01浓度为1×107CFU/mL,PBS清洗2～3次24孔板,每孔加入1 mL菌液,37 ℃培养90 min进行黏附实验。黏附完成后,PBS清洗未黏附的细胞,再加入1 mL无菌蒸馏水孵育60 min进行细胞裂解,将每孔中剩余的菌悬液吸出计数,每组3个平行,计算鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01与Caco-2细胞的黏附情况,以平均每个细胞黏附的鼠李糖乳杆菌数来判断其黏附强度,上述相同方法计算标准菌株ATCC7469与Caco-2细胞的黏附情况。

1.2.3.4 菌株疏水性和自聚力测定 根据Sabdshkumar等[14]的方法,略作修改。菌株过夜培养,5000 r/min下离心10 min,收集菌体沉淀,无菌PBS缓冲液洗涤菌体两次后,重悬于无菌PBS中,调节OD600=0.60±0.05(A0)。取2 mL菌悬液和2 mL二甲苯充分振荡混匀,室温静置30 min。小心吸取水相,以无菌PBS为空白测定OD600值(A1)。表面疏水性(%)=(1-A1/A0)×100。自聚力测定参考Todorov等[15]的方法,稍加修改。菌悬液制备同疏水性实验,取4 mL菌悬液,室温下静置24 h,小心吸取上层1 mL,测量OD600(A24)值。自聚力(%)=(1-A24/A0)×100。

1.3 数据处理

所有实验均重复处理3次,实验结果均表示为均值±标准偏差(M±SD)。采用Excel 2016统计软件进行统计学分析,数据间的分析方法采用单因素方差分析,显著水平设为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 菌株的鉴定结果

2.1.1 形态学分析 分离得到的菌株革兰氏染色后显微照片如图1,菌株在MRS固体培养基上37 ℃培养48 h后,菌落表面光滑有光泽,边缘整齐,椭圆形或圆形。

图1 LR-ZB1107-01革兰氏染色镜检Fig.1 Gram staining micrograph of LR-ZB1107-01

2.1.2 生理生化特征分析 菌株的生理生化特征鉴定结果如表1所示,根据糖发酵及生理生化鉴定结果,参照《伯杰氏细菌鉴定手册》第八版[10],可初步鉴定该菌株为鼠李糖乳杆菌。

表1 LR-ZB1107-01的生化特征及碳水化合物发酵实验结果Table 1 Biochemistry features and results of carbohydrate tests of LR-ZB1107-01

2.1.3 菌株的分子生物学鉴定 16S rDNA序列与GenBank中菌株进行同源性比较,结果表明该菌株与鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)ATCC53103同源性最高,达100%。于2019年4月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,简称CGMCC,保藏编号为CGMCC NO. 5172,将其命名为LR-ZB1107-01。该菌株的系统发育树如图2。

图2 LR-ZB1107-01系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of LR-ZB1107-01

2.2 安全性评价结果

2.2.1 菌株的溶血活性检测 溶血是指在溶血毒素及其他理化因素的作用下,红细胞破裂,血红蛋白逸出[16]。菌株代谢产物有无溶血活性被认为是菌株安全性评价的重要指标。如图3所示,a为鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01,周围无明显溶血圈形成,属于没有毒性的γ-溶血,b为阳性对照大肠杆菌,属于β-溶血组。

图3 溶血活性检测结果Fig.3 The results of hemolytic activity test

2.2.2 抗生素敏感性实验结果 K-B纸片扩散实验结果如表2,几种常见的抗生素对鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01有较强的抑制作用,结果根据表3判断。供试菌株对各种抗生素的抗性依据美国临床和实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)[17]制定的相关标准判断。

表2 K-B纸片扩散实验结果Table 2 K-B paper diffusion test results

表3 药敏纸片含药量及抗性判断标准Table 3 Drug sensitive paper containing drug content and resistance to determine the standard

2.2.3 动物急性毒性试验 在观察期内小鼠的活动、食欲正常,体重增加;试验结束后,对存活动物解剖,肉眼未见心肝脾肺肾肠等内脏器官异常。实验菌株LR-ZB1107-01对小鼠不具有急性毒性作用。

2.3 菌株的益生性研究

2.3.1 抑菌活性 乳酸菌的代谢产物在一定程度上可以抑制致病菌的增长[18],本实验选取金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、单增李斯特菌作为指示菌株,抑菌结果如表4所示,两株鼠李糖乳杆菌对三种指示菌株均有一定的抑制作用,抑菌圈直径均超过2 cm,其中LR-ZB1107-01对大肠杆菌和单增李斯特菌的抑制作用稍强于标准菌株。周鲜娇等[19]对分离自发酵酸菜中的鼠李糖乳杆菌进行抑菌活性测定,7株鼠李糖乳杆菌对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径在2～3 cm之间。

表4 鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01和标准菌株ATCC7469对四种指示菌的抑菌能力对比(cm)Table 4 The antibacterial ability of Lactobacillus rhamnosus ZB1107-01 and Lactobacillus rhamnosus ATCC7469(cm)

2.3.2 胃肠道耐受性 为在人体肠道内定殖并发挥其益生性能,鼠李糖乳杆菌需具有耐受胃肠道环境的能力。如图4(a)结果所示,LR-ZB1107-01在不同pH的人工胃液下存活状态良好,活菌数变化与其空白组比较没有显著差异(P<0.05),在pH=2的胃液中暴露3 h后存活率仍高于99%。图4(b)结果显示鼠李糖乳杆菌标准菌株在pH=2的胃液中暴露3 h后活菌数下降明显,耐受性低于LR-ZB1107-01。王玉华等[20]从婴儿粪便中筛选出的鼠李糖乳杆菌在pH=2的人工胃液环境中培养4 h后存活率约为57%。如图5所示,LR-ZB1107-01和鼠李糖乳杆菌标准菌株ATCC7469均对人工肠液的耐受性较好,且LR-ZB1107-01在人工肠液中随着时间的延长,活菌数略有增加。

图4 鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01(a)和标准菌株ATCC7469(b)对人工胃液耐受能力对比Fig.4 The survivability in artificial gastric ofLactobacillus rhamnosus ZB1107-01(a)and Lactobacillus rhamnosus ATCC7469(b)

图5 鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01(a)和标准菌株ATCC7469(b)对人工肠液耐受能力对比Fig.5 The survivability in artificial intestinal fluid ofLactobacillus rhamnosus ZB1107-01(a)and Lactobacillus rhamnosus ATCC7469(b)

2.3.3 肠道黏附性 黏附是鼠李糖乳杆菌与宿主肠道相互作用的第一步,是益生菌株在肠道内发挥益生功能从而调节肠道菌群健康的一个必要条件。Caco-2细胞模型是一种人克隆结肠癌细胞,结构和功能与分化后的小肠上皮细胞相似,可以模拟人肠道中的环境[21]。结果表明,LR-ZB1107-01可有效黏附于Caco-2细胞,平均黏附数为(13.3±3.2)个/细胞,标准菌株的黏附数为(12.8±2.4)个/细胞。薛银刚[22]从我国传统发酵制品中分离出的若干株乳酸菌对Caco-2细胞的黏附均值为10～19个/细胞。陈佩等[23]研究一株具有降糖作用的鼠李糖乳杆菌对Caco-2细胞的黏附值约为10个/细胞。

2.3.4 菌株的疏水性和自聚力检测 细菌的疏水性和自聚性是益生菌对肠道非特异性黏附的重要指标[24]。实验结果如表5所示,LR-ZB1107-01的疏水性高于鼠李糖乳杆菌标准菌株,达48.6%。两株菌的自聚力相差不大,均超过85%。熊世进等[25]测定人源鼠李糖乳杆菌MP-108的疏水性达90.10%,自聚力达51.54%,略高于LR-ZB1107-01。

表5 鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01和标准菌株ATCC7469的疏水性及自聚性能力对比Table 5 The ability of hydrophobicity and self-aggregation ofLR-ZB1107-01 and ATCC7469

从广州1月龄健康的婴儿粪便中分离出一株乳酸菌,经过形态学观察、生理生化特征分析以及生物学鉴定,可确定该菌株为鼠李糖乳杆菌(LactobacillusrhamnosusZB1107-01)。对鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01进行了安全性评价,结果表明该菌株不溶血,对抗生素敏感,动物急性毒性实验结果为无毒,该菌株安全。益生特性研究将LR-ZB1107-01与标准菌株ATCC7469进行对比,LR-ZB1107-01可有效抑制三种致病菌,对大肠杆菌和单增李斯特菌的抑制效果略强于标准菌株。LR-ZB1107-01对胃肠道环境高度耐受,表现出对酸(pH2)的强耐受性。自聚性和对Caco-2细胞的黏附性与标准菌株相当,疏水性能远高于标准菌株。本研究筛选出具有潜在利用价值的益生菌,丰富了我国的乳酸菌资源库,为开发新的乳酸菌产品创造条件,也为该菌在益生菌发酵工业的进一步利用提供了理论基础。