月见草素B及其生物活性研究进展

李 伟,张小英,陈 熔,苗建银,陈运娇,曹 庸

(华南农业大学食品学院,广东省功能食品活性物重点实验室,广东省天然活性物工程技术研究中心,广州 510642)

月见草素B(Oenothein B,OEB,图1)最初是从月见草属植物中分离出来的一种大环二聚体鞣花鞣质;现代研究指出桃金娘属、千屈菜属、柳叶菜属等植物中均可分离出OEB[1-3](表1)。这些属许多植物(百千层、香桃木、蓝桉等)传统上常用于各种医疗目的,如前列腺和肠胃疾病、伤口愈合和皮肤应激[4];经过大量体外和体内研究表明,OEB是这些植物提取物中存在的主要生物活性成分之一[5-7]。作为大环二聚体单宁,OEB属于水解单宁,其分子结构中有大量酯键和糖苷键,而二聚体结构和葡萄糖上没食子酰基为增强其生物活性所必需。已有研究指出OEB具备良好的抗肿瘤[8-9]、抗炎[10-11]及抗氧化[12-13]等生物活性,具有重要研究意义。但OEB规模化分离纯化困难,国内商业化产品价格昂贵;同时,特殊的多羟基结构造成其易被氧化,体内外稳定性较差。目前,国内关于OEB的研究论文较少,国外研究论文较多。结合国内外文献,本文旨在综述OEB的结构特性、理化性质及生物活性研究进展,以期为OEB深入研究提供研究思路。

图1 月见草素B结构式Fig.1 Structural formula of oenothein B

表1 OEB在植物中的分布Table 1 Distribution of oenothein B in plants

OEB被分离出来后是一种无定型的粉末,质谱结果表明其质荷比(m/z)为1569[M+H]+,分子式为C68H48O44。OEB结构上含有两个未酰基化葡萄糖母核,理论上可以形成四种难以分离的混合物,这也给后续光谱分析造成干扰。常温条件下氢谱信息中质子信号拓宽和倍增也是这类大环寡聚物的特征之一,这是由于葡萄糖母核上发生异构化导致。然而,在40～50 ℃条件下氢谱数据表明,在δ6.20(d,J=3.5 Hz)和δ4.48(d,J=7.5 Hz)处的特征信号分别是α-葡萄糖和β-葡萄糖[2]。NaBH4降解表明芳香区有6个1H单峰态和2个2H单峰态,证明两个葡糖糖母核上均有缬氨酰基、没食子酰基及葡萄糖醇基团,而基团之间的结合模式由1H-13C位移相关光谱和在OEB处理后获得的部分水解产物鉴定得出[25]。最终确定OEB结构上是以两个特里马素Ⅰ单元构成,其中以葡萄糖(α-葡萄糖和β-葡萄糖)为母核,结合没食子酰基以酯键和糖苷键的形式形成大环二聚体鞣花单宁[26]。

OEB是一种大环二聚体单宁,分子式C68H48O44,其常温下呈白色或者淡黄色粉末状[2]。OEB易溶于水、乙醇等极性溶剂,而在乙酸乙酯和石油醚等低极性溶剂中基本不溶。同时,OEB在高温(>80 ℃)、碱性pH(>7)以及消化系统水解酶(胰蛋白酶、脂肪酶)等条件下不稳定,容易发生水解,分解成酚酸类和多元醇等,造成功能活性降低[27]。曹素芳等[28]研究指出小鼠体内的代谢实验也表明OEB在体内代谢不稳定,在胃肠道中已经发生降解,生物利用率低。基于OEB相对分子量大、体内不稳定等特征,现代研究指出可采用纳米乳液[29]、微乳[30]以及脂质体[31]等稳态化技术进行包埋,以期提高OEB的稳定性。

2 月见草素B的生物活性

2.1 抗肿瘤

作为二聚体水解单宁的OEB,独特的结构赋予其良好的抗肿瘤活性。在已有的研究中,OEB除了对肿瘤细胞造成直接杀伤力和抑制/促进相关酶系活力之外,主要以宿主介导的抗肿瘤活性为主。围绕OEB与机体自身免疫对肿瘤的协同作用进行研究,以期探究OEB抗肿瘤作用机制，将OEB注射到小鼠腹腔中诱导腹腔中巨噬细胞产生腹膜渗出物,引起IL-1释放,结果表明OEB通过激活巨噬细胞分泌、增强宿主免疫,以达到抑制小鼠体内Meth·A型肿瘤细胞增长的作用[32]。这提示OEB等单宁类物质可能通过增强宿主细胞免疫活性进而达到抗癌的作用。相似研究指出二聚体马桑鞣素A和月见草素A同样能够增强机体免疫以达到宿主介导的抗肿瘤活性[33]。在MM2腹水肿瘤细胞模型中,提前4 d在小鼠腹腔接种S-180细胞,将45种鞣花酸类物质注射进小鼠体内,以小鼠寿命增加70%及以上作为评价抗癌效果指标,结果表明二聚体鞣花酸中OEB具有突出的抗癌活性;单宁单元体和二聚体单宁(OEB)表现出优越抗癌作用,这与结构中葡萄糖母核上2和3位置的没食子酰基有关[34]。此外,从细叶萼距花中分离出四种二聚体单宁,并对其抗肿瘤活性进行研究。其中OEB能显著抑制人体肿瘤细胞KB、Hela、Hep3B和HL-60等的生长,而对正常细胞的毒性更低,甚至低于抗肿瘤物质阿霉素;此外,还研究了OEB对S-180细胞和含有S-180瘤细胞的ICR小鼠的作用效果,结果发现体外实验中月见草素B对S-180细胞表现出很大细胞毒性(IC50=11.4 μg/mL),同时能显著提高接种S-180肿瘤细胞小鼠的存活率,表明OEB通过抑制S-180细胞活性起到抗肿瘤效果[35]。此外,上述研究提示OEB等二聚体单宁类物质的抗癌作用不是简单的细胞毒性作用,推测其通过改善宿主自身免疫调节功能从而达到最佳的抗肿瘤活性。

Vitalone等[36]发现柳叶菜属植物来源的OEB能抑制PZ-HPV-7、LNCaP、HMEC、1321N1四种细胞系的DNA合成,阻止前列腺细胞增殖;通过比较Epilobiumangustifolium和Epilobiumspicatum两种来源提取物抑制DNA合成的能力和OEB含量,研究发现前者提取物中OEB含量高于相同物种近40倍,抑制人体前列腺细胞系中DNA合成作用明显,推测OEB以非特异性的方式在抑制前列腺细胞的增殖中起作用。有研究指出这种抑制作用不是细胞毒性作用引起的,而是通过对细胞周期进程的干扰实现的[37]。同时,这也与OEB抑制前列腺增生进程中5α-还原酶和芳香化酶有关[38]。由于抑制前列腺细胞增殖被认为在治疗前列腺增生和肥大中是有用的,而这与前列腺炎症的发生相关。前列腺慢性炎症可能通过氧化应激或诱导诱变产生的活性氧导致前列腺癌的发生或肿瘤[39]。这提示OEB抑制前列腺细胞增生,在一定程度上能间接性缓解细胞炎症、降低肿瘤发生率。此外,相似研究指出OEB能抑制EBV病毒中DNA聚合酶的数量从而达到抑制肿瘤的作用[40]。有报道前列腺增生人体体内血管紧张素转化酶活力和血管紧张素Ⅱ含量显著高于正常人,这提示肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)的激活可能参与前列腺增生的病理生理过程。而同属锌金属肽酶的中性内肽酶能催化多种活性肽降解以改善前列腺增生的情况,甚至有研究认为中性内肽酶的变化与前列腺癌密切相关。通过PC-3细胞前列腺癌模型得出柳叶菜属水提取及从中分离的OEB统计学上显著提高中性内肽酶的活性,一定程度上有利于减缓前列腺增生,这与其抑制细胞内5α-还原酶相关酶类有关,为民间药物提供了药理方面的解释[41]。

2.2 抗炎作用

炎症是机体受到外界刺激而引起的一系列生理生化变化的病理过程。临床上非甾体类抗炎药、甾体类抗炎药及中药常被用来阻断炎症反应。化学合成抗炎药物使用过程中机体逐渐产生的抗药性及毒副作用,而天然产物中抗炎活性成分因毒副作用小、效果显著等特点受到研究人员的青睐[42]。研究报道指出OEB具有良好的抗炎作用,能有效降低LPS和TLR4诱导的NO含量、iNOS基因及蛋白的表达水平,这与它减少了NF-κβ(p50)亚基与生物素化的共有序列的结合并降低了NF-κβ(p65)易位有关;同时OEB能有效抑制炎症介质(肿瘤坏死因子、白介素-6)分泌[11]。相似研究发现OEB能显著抑制NF-κβ活性,降低因激活NF-κβ引起的iNOS基因过度表达,达到缓解炎症的作用[10]。此外,OEB有效抑制嗜中性粒细胞中髓过氧化物酶(MPO)产生,这与OEB能抑制脂肪氧合酶活性有关;同时,研究发现OEB作为一种有效COX-1抑制剂,能有效地缓解炎症,起到类似于抗炎药吲哚美辛的作用[6]。这表明OEB在体外细胞模型中能有效降低刺激物导致的细胞炎症现象,为开展体内抗炎实验提供基本的研究数据。有报道以脂多糖注射到ICR小鼠腹膜进行造模,研究小鼠口服OEB对全身炎症引起的中枢神经系统损伤的影响。结果表明口服OEB组小鼠显著抑制旷场实验中LPS诱导造成的小鼠异常行为、海马和纹状体中小胶质细胞活化和COX-2的产生;在系统性炎症过程中,OEB具有缓解脑中神经炎症的能力[43]。OEB相对分子量为1569,在体内很难被直接吸收利用起到抗炎作用。有研究指出鞣花单宁容易被肠道菌群代谢成更小的代谢物,这些代谢物对结肠成纤维细胞有抗炎作用[44-45]。这些发现也表明OEB可能在体内与肠道菌群发生作用,生成更小的代谢物,再起到抗炎作用。综上,OEB在体内外均有良好的抗炎活性,但其在体内代谢过程中产生的代谢物仍需深入研究,尤其是抗炎代谢组分。

2.3 免疫调节作用

免疫作用是机体实现自我保护的重要方式,适度的免疫反应对机体健康至关重要。激活巨噬细胞和T细胞等免疫细胞、诱导产生免疫调节因子及提高免疫球蛋白等途径都能有效提高机体免疫调节作用。有报道发现OEB显著下调人类树突状细胞(DC)细胞表面上CD1a和CD83的表达,抑制DC的分化和成熟,对机体起到免疫调节作用;这种抑制作用与诱导细胞凋亡相关,细胞有明显核缩合的形态特征支持了上述观点[46]。目前,研究表明OEB通过下调细胞因子、诱导DC功能障碍以及细胞凋亡来发挥外周免疫调节作用,这些研究一定程度上揭示含鞣质的药用植物用于治疗各种炎性疾病的传统用途。OEB等多酚类化合物不仅通过传统的抗氧化作用起到对机体的保护作用,它还能调节细胞反应引起机体的免疫调节作用。例如,研究指出OEB能发挥抗肿瘤作用,但这一定程度上是通过诱导机体白介素-1β含量上升促进宿主免疫调节作用而实现的。Schepetkin等[47]发现柳叶菜属提取物中OEB是引起中性粒细胞和巨噬细胞活化的主要成分,OEB被注入到小鼠腹腔后引发原发性嗜中性粒细胞趋化剂IL-8和嗜中性粒细胞在小鼠腹膜聚集从而起到免疫调节作用;此外,OEB在体外诱导吞噬细胞发挥功能,包括细胞内Ca2+通量、活性氧的产生、趋化性、NF-κβ活化和促炎细胞因子的产生等。Ramstead等[48]指出OEB能刺激牛和人淋巴细胞(T细胞和NK细胞),诱导细胞表面抗体表达(CD25或CD69);还发现了OEB能单独或与白介素-18(IL-18)共同作用以促进牛和人的NK细胞产生干扰素-c(IFNc)。干扰素有助于提高机体抗肿瘤、抗菌及抗病毒作用,这也部分解释了OEB增强机体免疫的作用机制。另外,OEB作为一种相对分子量较大的鞣花单宁,常规情况下其难以被直接吸收起到免疫调节作用。有研究指出以OEB分子式上的子结构物质为参比对象(没食子酸、邻苯二酚、邻苯三酚、3,4-二羟基苯甲酸等),发现OEB完整结构在体内外才具有更强调节细胞吞噬功能的作用。这也说明OEB很有可能不是直接调节机体的免疫调节功能,而是以促进机体产生自身免疫的方式。此外,OEB在体内被肠道微生物代谢成其他的功能小分子,也有可能是促进机体免疫的重要原因之一。

2.4 抗氧化

目前,单宁类物质已被证实具有明确的抗氧化、抗衰老等作用[49-53]。OEB结构上22个酚羟基有助于增强其抗氧化活性,达到淬灭O2-和DPPH自由基的作用,其IC50分别为0.9和6.1 μmoL/L[54]。从桃金娘科桉树叶中分离出十种酚类化合物,其中OEB能有效的清除DPPH自由基(EC50=6.12 μmoL/L),起到抗氧化作用[55]。Amakura等[14]研究指出桉叶提取物在DPPH和ORAC体外抗氧化评价中表现良好的抗氧化活性,通过HPLC液相色谱分析得出主峰包括没食子酸、鞣花酸及OEB等物质;同时基于抗氧化活性、液相色谱分离度及相对稳定性,提出OEB可作为桉树叶提取物标志成分之一。OEB和鞣花酸是多酚化合物,其氧化机理是pH依赖性的,涉及不同数量的电子和质子。OEB除了具有明确的抗氧化能力外,在延缓衰老方面也有不少研究。陈运娇[56]发现OEB处理野生型秀丽线虫后平均寿命延长22%,线虫运动能力增强,并能降低后期老年斑含量。根据自由基理论,推测OEB通过阻断自由基反应、清除过剩自由基,直接或者间接地通过增强抗氧化性而起到延缓衰老的作用[57]。

2.5 其它作用

OEB除了上述抗肿瘤、抗炎、免疫调节及抗氧化作用,还有抗真菌等作用。有研究表明从扁樱桃中分离得到的OEB具有有效的抗真菌作用,它能干扰巴西副球孢子菌形态,表现在细胞表面粗糙和细胞壁破裂。它抑制了参与细胞壁的1,3-β-D-葡聚糖合酶(PbFKS1)基因的转录,干扰了巴西副球孢子菌的细胞形态[58]。为了阐明候选化合物OEB的作用模式,通过代表性差异分析(RDA)进一步分析OEB处理巴西副球孢子菌后基因的变化,发现OEB调控合成细胞壁的关键基因(GLN1、KRE6、FKS1);此外,OEB还参与涉及维持细胞膜形态和压力等细胞过程[59]。这些结果都表明OEB能起到有效的抗真菌作用,主要通过参与细胞壁合成的相关途径起作用,为其他植物化合物抗真菌作用机制提供一定的借鉴。此外,许多单宁酸及相关的多酚类化合物对直接作用的诱变剂均具有抗诱变活性,这表明这些化合物可潜在地对抗氧介导的DNA损伤,也有研究报道OEB具有类似的作用。Silva等以SOS-Inductest和体内小鼠骨髓微核(MN)为模型,表明OEB没有任何遗传毒性,再用两种试验联合使用丝裂霉素C来评估OEB的抗原毒性和抗细胞毒性活性,它表现出对由丝裂霉素C诱导的原代DNA损伤的体内保护活性[60]。另有研究发现OEB具有抗病毒作用,能有效抑制巴尔病毒(EBV)DNA聚合酶,从而达到抑制EBV复制的效果[40]。天然植物来源的OEB在体内外具有多种生物活性,其优异的抗菌、抗诱变及抗病毒活性是进一步研究利用的基础,但现阶段需要更深入的研究其作用机制。

3 结语与展望

作为大环二聚体鞣花单宁,月见草素B具有良好的生物活性,自发现以来其在抗肿瘤、抗炎、免疫调节及抗氧化等方面展现显著效果,研究与应用前景十分广阔。从生物活性的角度来看,OEB早期研究主要体现在其抗肿瘤作用,受限于技术的发展研究层次不高,且抗肿瘤的作用机理不明确,往后的研究可依托于现代先进的分子技术,从基因、蛋白质的层面深入考察OEB的作用机理。同时,OEB在抗炎、免疫调节及抗氧化等方面研究相对较少,仍然需要大量的基础研究。另,高分子量的物质常因为溶解度和稳定性等原因造成生物利用度比较低,故OEB的高分子量与其高生物活性之间的关系需要谨慎解释。总体而言,OEB作为一种高分子量的大环二聚体鞣花酸,高效的生物活性使其具有重要的研究及应用价值。