响应面优化酶促水解鲅鱼蛋白制备ACE 抑制肽的研究*

吴若晨 吴正浩 冯译萱 梁晓丽 黄光荣*

（中国计量大学生命科学学院，浙江杭州 310018）

高血压是现代社会人们面临的重要健康问题，据统计分析，2010 年—2012 年我国18 岁以上人口高血压患病率约23%。研究表明，血压水平和动脉硬化、中风等心血管疾病有直接联系。在人体中，血管紧张素转换酶（ACE）水解血管紧张素Ⅰ羧基末端二肽His-Leu 产生血管紧张素Ⅱ，是已知的最容易引起血管收缩的物质之一，而ACE 抑制肽与血管紧张素Ⅰ形成竞争性抑制，有助于维持血压平稳。海洋鱼类蛋白拥有丰富的氨基酸结构，是生物活性肽的巨大来源，开发利用海洋鱼类蛋白中的ACE 抑制肽受到越来越多的关注。

鲅鱼（Scomberomorus niphonius）学名为蓝点马鲛，属于鲈形目鲅科，俗称燕鱼、青箭等，其可食用部分营养丰富，富含蛋白质、维生素A 和多种矿物质等。鲅鱼种类较多，一些低值小鲅鱼利用率较低，造成资源大量浪费。目前，由鱼类蛋白制备ACE 抑制肽的常用方法是酶水解法和微生物发酵法。Zhang 等用中性蛋白酶水解水母性腺，获得了一种IC50值为1 164.18 μmol/L 的SY 肽；Toopcham等用卤代硝酸菌SK1-3-7 蛋白酶水解罗非鱼肉糜获得一种具有良好热稳定性与pH 稳定性的ACE 抑制肽;Zhang 等将巴沙鱼皮用蛋白酶水解，使用响应面法建立数学模型优化水解条件，发现水解产物具有较高的ACE 抑制活性。目前对以小鲅鱼或其加工副产物为原料，制备抗氧化肽、抗菌肽等的研究较多，而关于鲅鱼蛋白质水解制备ACE 抑制肽的研究较少。本研究以低值小鲅鱼为原料制备鲅鱼蛋白酶解液，并对鲅鱼蛋白酶解液的体外ACE 抑制率进行研究，为低值小鲅鱼的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

小鲅鱼干，购自浙江省温州洞头区水产品市场。

1.2 试验方法

1.2.1 原料预处理

小鲅鱼干，去头、尾，于80 ℃烘干，粉碎过100 目筛，以石油醚为溶剂进行回流脱脂，室温挥发石油醚后，再于80 ℃烘干，粉碎过100 目筛，所得鲅鱼脱脂粉于玻璃瓶中低温密封保存。

1.2.2 酶促水解基本工艺

称取0.3 g 脱脂鱼粉于锥形瓶中，加一定pH 值的Tris-HCl 缓冲液20 mL，摇匀后加一定量的蛋白酶，在恒温振荡水浴（200 r/min）中水解一定时间后，90 ℃水浴中灭酶10 min，冷却离心（10 000 r/min，4 ℃，20 min），收集上清液，4 ℃保存备用。

1.2.3 蛋白酶筛选

参考苑园园等的方法，分别用碱性蛋白酶（50 ℃、pH 8.5）、风味蛋白酶（50 ℃、pH 7.0）、胰蛋白酶（37 ℃、pH 8.0）作水解用酶，以水解度、ACE 抑制率为指标，筛选出最适的蛋白酶。

1.2.4 单因素试验

分别以水解温度（30 ℃～60 ℃）、pH 值（7.0～9.5）、蛋白酶添加量（3 000 U/g～17 000 U/g鱼粉质量）、水解时间（1 h～5 h）、料液比（5 g/L～100 g/L）为单因素进行水解试验，测定水解度和ACE 抑制率。

1.2.5 酶解条件响应面优化

在单因素试验的基础上，选取水解时间、水解温度、pH 值、酶添加量4 个因素进一步优化，以单因素试验中较佳水平为中心点，ACE 抑制率为响应值，利用CCD（Central Composite Design）进行响应面试验设计。四因素三水平编码表如表1 所示。

表1 响应面试验因素水平编码值表

1.3 测定方法

1.3.1 蛋白质含量测定

以BSA 为标准品用福林酚法测定可溶性蛋白质的含量。总蛋白质含量测定采用碱溶法，即样品先用2 mol/L NaOH 提取4 h 后采用福林酚法测定可溶性蛋白质含量。

1.3.2 水解度测定

根据Pericin 等的方法测定三氯乙酸（TCA）可溶性多肽含量。以水解液中TCA 可溶性多肽占水解前总蛋白质量的百分比来表示水解度（DH）。

1.3.3 ACE 抑制率测定

将样品蛋白浓度调整到1.0 mg/mL，然后参照苑园园等的方法，以高效液相色谱法测定空白或添加了样品溶液的ACE 水解HHL 三肽后释放出的马尿酸含量，计算出ACE 抑制率。

1.4 数据分析与处理

所有试验重复3 次，结果以平均值±标准偏差表示，并采用Design Expert 10 和Origin 8.0 软件对数据进行分析和处理。

2 结果与分析

2.1 蛋白酶的筛选

选择常见的3 种蛋白酶对脱脂鲅鱼粉进行酶促水解，测定其水解度和ACE 抑制率，结果如图1所示。从图1 可以看出，胰蛋白酶和碱性蛋白酶水解后均有较高的ACE 抑制率，但是碱性蛋白酶比胰蛋白酶水解时的水解度更高，因此选择碱性蛋白酶为最佳水解用蛋白酶。

图1 不同蛋白酶对鲅鱼蛋白质水解的影响

2.2 单因素试验

在其他条件固定的情况下，分别研究了料液比、酶添加量、水解温度、pH 值和水解时间对鲅鱼蛋白质酶促水解过程的影响，测定水解液的ACE抑制率和水解度，结果如图2～图6 所示。

图2 料液比对鲅鱼蛋白质水解的影响

图3 加酶量对鲅鱼蛋白质水解的影响

由图2 可知，水解度先随料液比上升而上升，当料液比在10 g/L 时水解度高于其他水平，此后水解度降低，ACE 抑制率则大致呈现随料液比增大而逐步上升的趋势。由图3 可知，水解度随酶添加量先增加后下降，在9 000 U/g 时最高，而水解液ACE 抑制率则在酶添加量为5 000 U/g 时最高。

图4 温度对鲅鱼蛋白质水解的影响

由图4 可知，水解度在水解温度为40 ℃时最高，但水解液ACE 抑制率在50 ℃时最高。

图5 pH 对鲅鱼蛋白质水解的影响

由图5 可知，水解度在pH 8.5 表现出较高值，这是碱性蛋白酶的特点，但水解液ACE 抑制率却并未出现有规律的变化，在pH 9.0 时表现出最大相对抗凝血活性。

图6 水解时间对鲅鱼蛋白质水解的影响

从图6 可知，水解时间越长，水解液ACE 抑制率越高，但在4 h 后开始下降，水解度也随着水解时间增加而增加，但在4 h 后逐渐减小。因此，通过单因素试验确定下一步响应面优化水解条件的因素为碱性蛋白酶添加量、水解温度、水解时间和pH 值，其中心点分别为9 000 U/g、50 ℃、4 h 和8.5。

2.3 响应面法优化

根据单因素试验结果可知，影响鲅鱼蛋白质水解制备ACE 抑制肽的主要因素有：pH 值、酶添加量、水解时间和水解温度。因此，选择这4 个影响因素进行响应面中心组合设计进行优化，响应面试验结果见表2，方差分析表见表3。

表2 响应面试验结果

表3 响应面试验方差分析

对响应面试验数据进行分析处理，得到的二次多项式方程：

Y=+42.00+0.40A+2.89B-0.20C+5.99D+1.98AB-0.66AC-0.71AD+0.24BC+0.42BD+1.71CD-3.01A2-0.95B2-1.95C2-3.14D2。其中，Y 为ACE 抑制率（%），A 为pH，B 为水解温度（℃），C 为水解时间（h），D 为酶添加量（U/g）。由表3 可知，该模型显著（F=9.75，P＜0.0001）。模型的决定系数R2为0.9010，说明该模型拟合度较好，是相对可靠的。4 个因素的显著性影响大小依次为：酶添加量>水解温度>pH 值>水解时间。其中酶添加量、水解温度表现显著，因此可看出酶添加量、水解温度对于水解液ACE 抑制率的影响较大。

根据表3 中的交叉因素分析表明，pH 值与水解温度、水解时间与酶添加量的交互作用比较明显（P<0.1），其交互作用如图7 和图8 所示，可直观反映pH 值与温度、酶添加量与反应时间相互作用对ACE 抑制率的影响。网状图形上部空间曲面的陡峭程度反映的是此自变量因素对ACE 抑制率这一响应值的影响程度，位于图像下部等值线图的椭圆离心率则反映了因素互相作用的效果大小。各曲面顶点是影响酶解效果各作用因素的最佳条件。用Design Expert 10 软件预测得到的最优水解条件为：碱性蛋白酶添加量9 981 U/g，水解温度55 ℃，水解时间4.27 h，水解pH 值9.0，此时ACE 抑制率可达到46.02%。在该条件下重复3 次验证试验，测得水解液的ACE 抑制率为45.5%，与预测值较为相近。

图7 pH 值与水解温度的相互作用

图8 水解时间与酶添加量的相互作用

3 结论

鲅鱼是我国产量较高的海洋低值鱼类，本研究以海洋低值小鲅鱼为原料，脱脂后选用碱性蛋白酶水解，获得具有较高ACE 抑制率的水解液，在单因素试验的基础上，采用响应面设计优化得到最佳水解条件为：碱性蛋白酶添加量9 981 U/g，水解温度55 ℃，水解时间4.27 h，水解pH 值9.0，此时，ACE 抑制率可达45.5%。研究结果初步表明，海洋低值小鲅鱼可以作为降血压保健食品的功效性基料。