醇-碱法提取啤酒糟中蛋白质的研究

曲亮璠 肖海燕 薛 薇 沙印发 刘 然,4 王祥河

1（天津市工业微生物研究所有限公司，天津 300462）

2（天津量信检验认证技术有限公司，天津 300462）

3（天津实发中科百奥工业生物技术有限公司，天津 300462）

4（天津市工业微生物企业重点实验室，天津 300462）

啤酒糟又称为麦糟、麦芽糟，是我国酿酒工业的副产物，产量巨大，价格低廉。啤酒糟是麦芽、啤酒花等原料经过糖化、糊化等工艺后，通过压滤所得的固体残留物质，其蛋白质含量显著高于其他种类酒糟（如薯类、玉米、高粱、青稞等），常应用于微生物发酵和制作反刍动物的粗饲料等，经济效益甚微。在生产旺季，由于生产厂家不能及时回收利用，将啤酒糟直接排放，不仅导致资源浪费，还对环境造成了极大影响。啤酒糟富含大量活性肽、低聚糖、膳食纤维等具有生物活性的功能成分，具有抗肿瘤、降血糖、抗菌、抗氧化等作用，极具开发价值。据文献报道，啤酒糟中蛋白质含量高达20%～30%，如何对其提取利用逐渐成为近年来研究的热点。目前，从啤酒糟中提取蛋白质的方法主要有碱提取法、醇提取法、醇-碱提取法，其中醇-碱法对啤酒糟蛋白的提取率较高，应用也最为广泛。

本文采用醇-碱法提取啤酒糟中的粗蛋白，对料液比、醇碱比、提取时间、提取温度等条件的影响进行了考察，通过三因素三水平正交试验优化了啤酒糟中粗蛋白的提取工艺条件，为废弃啤酒糟中蛋白质提取与功能性多肽的制备提供了试验依据，奠定了理论基础，为啤酒糟的综合利用提供了新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

啤酒糟，雪花啤酒厂。

硫酸铜、硫酸钾、硫酸、盐酸、硼酸、甲基红指示剂、溴甲酚绿指示剂、亚甲基蓝指示剂、氢氧化钠、乙醇等试剂，均为分析纯。

1.2 仪器与设备

AE200 分析天平；Seven Multi pH 计，梅特勒-托利多集团；GZX-9146 MBE 数显鼓风干燥箱上海博迅；GL-20G-II 高速冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂；K9840 自动凯氏定氮仪，海能仪器股份有限公司；河北巨轮微型高速万能试样粉碎机，河北巨轮贸易有限公司；KQ-250E 超声清洗器，昆山舒美超声仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 啤酒糟蛋白提取工艺

1.3.1.1 啤酒糟原料预处理

将新鲜的啤酒糟置于70 ℃烘箱内鼓风烘干，用微型高速万能试样粉碎机粉碎，过80 目筛储存备用。

1.3.1.2 提取工艺

称取2.00 g 啤酒糟干粉于250 mL 锥形瓶中，加入一定量95%乙醇溶液和0.05 mol/L 的NaOH 溶液，超声浸提后4 000 r/min 离心10 min，收集滤液，用稀盐酸将所得滤液pH 值调至等电点，再次离心，弃去上清液，60 ℃干燥得到啤酒糟粗蛋白。

1.3.2 啤酒糟蛋白等电点测定方法

用天平准确称量10.00 g 啤酒糟干粉于1 L 烧杯中，加入350 mL 醇碱比为1：4 的溶液（其中乙醇试剂纯度为95%，NaOH 溶液浓度为0.05 mol/L），45 ℃超声提取90 min 后，用布氏漏斗进行抽滤。将所得啤酒糟蛋白溶液定容至500 mL 并分装至烧杯中（每个烧杯量取40 mL），用盐酸调节溶液pH值分别为4.50、4.75、5.00、5.25、5.50，每组2个平行，静置5 min～10 min 后，4 000 r/min 离心10 min，将所得蛋白质沉淀洗涤、干燥称重。其中，沉淀量最多所对应的pH 值最接近啤酒糟蛋白质的等电点。

1.3.3 蛋白质含量测定

采用GB 5009.5——2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》中凯氏定氮法测定样品中蛋白质含量。

1.3.4 啤酒糟蛋白提取率的测定

式中：X——啤酒糟蛋白提取率，%；

m1——提取得到的粗蛋白质量，g；

m0——原料中蛋白质质量，g。

1.3.5 单因素试验方法

称取啤酒糟干粉2.00 g 于烧杯中，分别以不同料液比（1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40）；不同醇碱比（2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5）；不同提取温度（35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃）；不同提取时间（45 min、60 min、75 min、90 min、105 min、120 min）为变量进行啤酒糟粗蛋白提取的单因素试验，提取完成后，将浸提液4 000 r/min 离心10 min，弃沉淀，收集滤液，用盐酸调节滤液pH 值至等电点，再次离心，弃上清，收集沉淀，60 ℃烘干至恒重，通过计算求得啤酒糟粗蛋白的提取率。

1.3.6 正交试验

在单因素试验结果的基础上，选取对醇-碱法提取啤酒糟中粗蛋白影响较大的料液比、醇碱比、提取时间3 个因素，以啤酒糟粗蛋白提取率为指标，进行三因素三水平正交优化试验，以期获得最佳提取条件。

2 结果与分析

2.1 啤酒糟蛋白等电点测定

按上述试验方法，确定醇-碱法提取啤酒糟中蛋白质的等电点，结果见表1。

表1 啤酒糟蛋白质等电点的确定

当醇-碱法提取的啤酒糟蛋白处于某一特定的pH 环境中，其蛋白质分子所带正、负电荷恰好相等，即净电荷为零，呈兼性离子，此时啤酒糟蛋白分子在溶液中没有相同电荷的相互排斥，分子相互之间的作用力减弱，极易碰撞，易于凝聚而产生沉淀，溶解度最小，此时溶液的pH 值被称为蛋白质的等电点。除此之外，蛋白质在等电点时，渗透压、黏度、膨胀性等都变小，从而有利于啤酒糟蛋白悬浮液的过滤分离。由表1 可知，当pH 值为4.75 时，提取液中啤酒糟粗蛋白的沉淀量最大，即pH4.75 最为接近其等电点。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 不同料液比对啤酒糟粗蛋白提取率的影响

不同料液比对啤酒糟粗蛋白提取率的影响如图1 所示。由于蛋白质从啤酒糟中迁移到醇-碱溶液里受到了浓度差的推动，所以料液比对啤酒糟粗蛋白提取率的影响较大。

图1 不同料液比对啤酒糟粗蛋白提取率的影响

由图1 可知，随着啤酒糟原料和提取液的比例从1∶20 增加至1∶40，提取率呈现先增大后减小的趋势。若蛋白质已充分溶解在提取液中，即使增加固液比，所溶出的蛋白质也不会明显增加。此时，啤酒糟中多酚、水溶性多糖等成分的溶出也逐渐增多，这些成分易于和啤酒糟蛋白结合成不溶于提取液的聚合体而沉降，所以离心后滤液中所得蛋白质的含量减少，提取率降低。当啤酒糟原料和提取液之比为1∶35 时，啤酒糟粗蛋白的提取率为83.13%，高于其他组。因此，确定选择料液比为1∶35。

2.2.2 不同醇碱比对啤酒糟粗蛋白提取率的影响

不同醇碱比对啤酒糟粗蛋白提取率的影响如图2 所示。

图2 不同醇碱比对啤酒糟粗蛋白提取率的影响

根据啤酒糟中蛋白质在不同溶剂中的溶解性质，选用对目标成分溶解度较大的乙醇和NaOH 溶液，将蛋白质从物料组织内溶解出来。由图2 可知，啤酒糟粗蛋白的提取率随着NaOH 与乙醇体积比的升高呈现先增大后减小的趋势。溶于碱溶液的谷蛋白和溶于乙醇的醇溶蛋白是啤酒糟蛋白的主要构成成分，且其中谷蛋白的含量高于醇溶蛋白的含量，所以提取剂中NaOH 的体积比适当高一些，提取效果较好。当醇-碱的体积比为2∶1 时，蛋白质的提取率最低，仅为7.78%；当醇-碱醇碱的体积比为1∶4 时，啤酒糟蛋白质的提取率最高，达到83.10%。因此将啤酒糟粗蛋白提取剂的醇碱体积比选为1∶4。

2.2.3 不同提取温度对啤酒糟粗蛋白提取率的影响

不同提取温度对啤酒糟粗蛋白提取率的影响如下页图3 所示。

由下页图3 可知，当提取温度分别为35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃时，啤酒糟粗蛋白的提取率分别为77.25%、80.47%、83.09%、75.66%、70.32%。这是由于啤酒糟蛋白被纤维素紧紧包埋住，而热效应对纤维素有破坏作用，随着提取温度的不断升高，纤维的降解作用越来越强，蛋白的提取率会随着提取温度的升高不断增大。但是当提取温度超过45 ℃时，提取液颜色逐渐变深，啤酒糟蛋白的提取率逐渐下降。因此选择提取温度为45 ℃。

图3 不同提取温度对啤酒糟粗蛋白提取率的影响

2.2.4 不同提取时间对啤酒糟粗蛋白提取率的影响

不同提取时间对啤酒糟粗蛋白提取率的影响如图4 所示。提取时间的长短影响啤酒糟蛋白质的浸出量。

图4 不同提取时间对啤酒糟粗蛋白提取率的影响

由图4 可知，提取时间分别为45 min、60 min、75 min、90 min、105 min、120 min 时，蛋白的提取率分别为42.86%、50.83%、79.29%、83.12%、79.33%、69.77%。当提取时间在45 min～90 min 范围时，蛋白质的提取率随提取时间增加逐渐升高；当提取时间高于90 min 时，蛋白的提取率有所下降。这可能是随着提取时间的延长，可溶解在溶剂中的蛋白质已经充分浸提出来，在此条件下再延长提取过程中料液的相互作用时间，原料中少量的多酚或其他物质也被提取出，可与溶出的蛋白质形成不溶性物质沉淀下来，使得提取液中的蛋白含量减少。因此，综合考虑蛋白质的提取率和质量，选择提取时间为90 min。

2.3 正交试验

根据上述单因素试验结果，即以料液比1∶30、1∶35、1∶40，醇碱比1∶3、1∶4、1∶5，提取时间75 min、90 min、105 min 为影响因素和水平，以啤酒糟粗蛋白提取率为指标进行正交试验，正交因素与水平见表2，正交试验结果见表3，方差分析见表4，验证试验见表5。

表2 因素水平表

表3 正交实验结果

表4 正交试验方差分析结果

由表3 和表4 可知，料液比、醇碱比两种因素对啤酒糟粗蛋白的提取率均有显著性影响；通过极差值和F 值大小判断3 个因素对 响应值的影响主次顺序为：料液比>醇碱比>提取时间。啤酒糟粗蛋白的最佳提取条件为A2B2C2，即：料液比1∶35，醇碱比1∶4，提取时间90 min。

2.4 优化条件的验证

由正交试验优化出醇-碱法提取啤酒糟粗蛋白的最佳工艺（A2B2C2）并未在正交试验表中出现，所以需要按照相应的优化条件进行验证试验，试验结果如表5 所示。

表5 验证试验结果

结果表明，在料液比1∶35，醇碱比1∶4，提取时间90 min 的条件下，醇-碱法提取啤酒糟粗蛋白的提取率为85.66%，高于正交试验各组所得数据，说明正交优化试验真实有效。采用凯氏定氮法对粗蛋白提取物中的含氮量进行测定，粗蛋白纯度为48.60%。

3 结论

采用醇-碱法提取啤酒糟中的粗蛋白，试验结果表明不同料液比、醇碱比、提取温度、提取时间等条件对提取率均有一定影响。通过三因素三水平的正交试验得到啤酒糟粗蛋白的最佳提取工艺为：料液比1∶35，醇碱比1∶4，提取时间90 min。此条件下，粗蛋白的提取率85.66%，蛋白质纯度48.60%。