芦荟苷预处理对大鼠心肌缺血/再灌注性损伤的保护作用

张红素 冯梅

急性心肌梗死则是导致冠心病患者猝死的主要原因，在心肌恢复血流灌注后，可能导致心肌进一步受损，表现为心肌顿抑、及再灌注性心律失常，这种现象被称为心肌缺血-再灌注损伤(MIRI)[1]。研究表明，MIRI病理进展与细胞内钙超载、氧化应激损伤、炎性反应激活、心肌细胞凋亡等有关[2]。Akt/eNOS信号通路MIRI后心肌细胞的保护通路之一，主要通过Akt的磷酸化发挥心肌细胞抗凋亡作用[3]。研究表明，MIRI时Akt磷酸化水平提高可诱导eNOS产生进而发挥心肌保护作用，eNOS的高表达可防止细胞内钙超载、调节心肌血流，抑制血管痉挛、减少炎性细胞浸润等环节[4,5]。芦荟苷(Barbaloin,BAR)，作为芦荟的重要活性物质，是从芦荟中提取得到的蒽醌类化合物，既往研究显示，BAR可能通过激活AMPK信号通路抑制心肌缺血再灌注引起的心肌细胞凋亡[6]。本研究探索BAR预处理对于MIRI时心肌氧化应激水平、心肌细胞凋亡及Akt/eNOS信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 12周龄SPF级雄性SD大鼠72只，体质量200～230 g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供，动物合格证号：0016759。

1.2 药品与试剂 芦荟苷(北京贝尔兰科生物科技有限公司提供，批号：110787)；地尔硫卓(河南省国药医药有限公司，批号：42399-41-7)；戊巴比妥钠(Bio-Rad公司)；0.9%氯化钠注射液(安徽双鹤药业有限责任公司)；大鼠一氧化氮(NO)及总抗氧化能力(TAOC)化学发光定量检测试剂盒(Thermo Fisher公司，批号：S0023；S0121)；大鼠丙二醛(MDA)，超氧化物歧化酶(SOD)，过氧化氢酶(CAT)，谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-px) Elisa试剂盒(南京建成生物科技有限公司提供)；Annexin V-FITC/PI双染法细胞凋亡检测试剂盒(上海博谷生物科技有限公司)；山羊抗大鼠内皮型一氧化氮合酶(p-eNOS)及磷酸化内皮型一氧化氮合酶(p-eNOS)抗体，小鼠抗大鼠蛋白激酶B(Akt)抗体及磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)抗体(Abcam公司)；小鼠抗山羊及兔抗小鼠二抗(中衫金桥)；DAB显色剂(Solarbio公司)。

1.3 仪器 大鼠TOPO呼吸机(赞德仪器有限公司)； 酶标仪(BioTek Epoch，美国伯腾仪器有限公司)；Attune NxT流式细胞仪(Thermo Fisher公司)；电泳仪(Bio-Rad，美国伯乐公司)；高速冷冻离心机(Eppendor-5810R，德国艾本德股份公司)；Olympus BX53导致荧光显微镜(日本Olympus公司)。

1.4 方法

1.4.1 动物模型的制作：大鼠称重后经腹腔注射3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉。气管插管连接TOPO大鼠呼吸机。连接多导生理记录仪，监测心电图及心率。备皮并消毒后，于左侧第3～4肋间，行开胸术，开睑器撑开，暴露心脏，在其下2 mm处，用6-0缝线结扎左冠状动脉前降支。心电图显示ST段弓背型抬高，维持30 min后解除结扎线，使左冠状动脉前降支恢复血流灌注，心电图显示ST段缓慢下移，表明再灌注成功。关闭胸腔，持续再灌注60 min后检测相关实验指标。

1.4.2 实验分组：72只SD大鼠随机分为6组，对照组，模型组，阳性对照组(地尔硫卓 0.01 mg/kg)，BAR低浓度预处理组(10 mg/kg)，BAR中浓度预处理组(50 mg/kg)和BAR高浓度预处理组(100 mg/kg)，每组12只。对照组大鼠麻醉后行开胸术，分离左前降支但不结扎，模型组于心肌缺血前1周给与同体积 0.9%氯化钠溶液腹腔注射1周，1次/d，再制作缺血再灌注模型，阳性对照组利用地尔硫卓 0.01 mg/kg连续灌胃一周，1次/d，后制作缺血再灌注模型，BAR低、中、高浓度预处理组于心肌缺血前1周给予10、50、100 mg/kg BAR腹腔注射，1次/d，持续1周，后行缺血/再灌注术。

1.4.3 血清及心肌组织氧化应激水平的检测：缺血/再灌注60 min后立即取各组大鼠腹主动脉血5 ml及心肌组织，按照化学定量检测试剂盒及Elisa说明书对NO、TAOC水平以及MDA、SOD、CAT、GSH-px含量进行检测。

1.4.4 流式细胞仪检测心肌细胞凋亡率：缺血/再灌注60 min后立即取各组大鼠心肌组织，充分剪碎，300目铜网过滤制成细胞悬液，调整各管的细胞数约为1×109/L，再取心肌细胞5×105个，以PBS液清洗，500 r/min 离心1 min，沉淀肺细胞，弃去上清液，加入结合缓冲液195 μl，悬浮肺细胞，加入Annexin V 5 μl，混匀后避光放置10 min，然后PBS液清洗，500 r/min离心1 min，沉淀肺细胞，以190 μl结合缓冲液重悬细胞，加入10 μl碘化丙啶(PI)，混匀后上机，行流式细胞术检测，用CellQuest Pro 软件分析细胞凋亡率。

1.4.5 Western blot检测Akt、eNOS蛋白磷酸化水平以及caspase-3，Bax/Bcl-2表达水平：缺血/再灌注60 min后立即取6组大鼠心肌组织，充分剪碎、研磨，3 ml/g蛋白裂解液充分裂解后，以10 000 g离心40 min。BCA法测定总蛋白浓度后分别将6组蛋白进行SDS-PAGE蛋白电泳，再分别进行转膜，封闭，一抗p-eNOS(1∶2 500)、eNOS(1∶4 000)、Akt(1∶5 000)、p-Akt(1 2 500)、caspase-3(1∶4 000)，Bax(1∶1 500)、Bcl-2(1∶2 000)孵育过夜，二抗孵育4 h，加入显色剂显色后，凝胶成像系统成像，Image J软件计算灰度值。

2 结果

2.1 动物存活情况 实验过程中共有8只大鼠死亡，因突发恶性心律失常死亡5只，出血死亡2只，设备故障死亡1只，余大鼠均存活并计入统计学分析。

2.2 6组大鼠血清及心肌组织NO、TAOC表达比较 模型组大鼠血清及心肌组织NO、TAOC显著低于对照组(P<0.01)，BAR组在血清及心肌组织NO、TAOC表达水平显著高于模型组(P<0.05)。见表1。

组别NO(μmol/L)血清心肌组织TAOC(mmol/g prot)血清心肌组织对照组(n=12)21.85±2.965.87±0.890.79±0.130.34±0.05模型组(n=9)8.31±1.75*1.72±0.63*0.27±0.33*0.16±0.08*阳性对照组(n=11)16.28±1.74△4.58±0.64#0.31±0.110.18±0.04BAR低浓度预处理组(n=10)9.03±1.082.84±0.31#0.32±0.140.16±0.11BAR中浓度预处理组(n=11)14.11±1.25△3.16±0.42#0.46±0.09#0.17±0.09BAR高浓度预处理组(n=11)15.91±1.62△5.07±0.67△0.63±0.12#0.23±0.07#

注：与对照组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，△P<0.01

2.3 6组大鼠血清及心肌组织MDA、SOD、CAT、GSH-px含量 模型组大鼠血清及心肌组织MDA含量均显著高于对照组(P<0.01)，但模型组血清及心肌组织SOD、CAT和GSH-px含量均显著低于对照组(P<0.01)；BAR低、中、高处理组中血清及心肌组织MDA含量显著下降，明显低于模型组(P<0.05)，BAR组中血清及心肌组织SOD、CAT、GSH-px含量均显著提高，均明显高于模型组(P<0.05)。见表2。

组别MDA(nmol/mg prot)血清心肌组织SOD(U/mg prot)血清心肌组织CAT(U/mg prot)血清心肌组织GSH-px(U/mg prot)血清心肌组织对照组(n=12)15.74±1.244.38±0.5923.83±3.798.06±1.23183.24±12.6813.76±1.4646.92±5.0724.78±2.46模型组(n=9)52.86±2.92*17.41±1.08*4.16±1.28*0.83±0.46*39.75±10.45*1.07±0.49*8.19±1.12*2.47±0.85*阳性对照组(n=11)22.55±2.75△8.39±1.05#12.95±1.17#8.49±1.29△88.36±8.46#7.19±0.96△25.71±2.62#8.88±1.75#BAR低浓度预处理组 (n=10)42.96±3.78#15.93±1.325.94±2.112.82±0.64#49.27±9.75#3.94±1.08#16.11±1.02#9.14±1.18#BAR中浓度预处理组 (n=11)36.23±4.06#10.45±1.18#11.09±3.14#8.43±1.06△68.29±11.35#6.18±0.94#27.52±2.13#12.76±1.59#BAR高浓度预处理组 (n=11)30.28±2.56△6.88±2.07#16.75±1.54#13.22±2.09△99.41±10.58△8.77±0.92#33.09±3.16△19.14±1.67△

注：与对照组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，△P<0.01

2.4 6组大鼠心肌细胞凋亡比较 模型组大鼠心肌细胞凋亡率明显高于对照组(P<0.01)，BAR低、中、高预处理组显著低于模型组，并呈剂量依赖趋势(P<0.05)。见表3,图1。

2.5 6组大鼠Akt、eNOS蛋白磷酸化水平比较 结果显示，与对照组比较，模型组大鼠心肌组织Akt、eNOS蛋白磷酸化水平明显降低(P<0.01)，与模型组比较，BAR低、中、高处理组组心肌组织Akt、eNOS蛋白磷酸化水平显著升高(P<0.05)。见表4。

组别凋亡率对照组(n=12)3.76±1.49模型组(n=9)19.61±1.75*阳性对照组(n=11)7.29±1.06△BAR低浓度预处理组(n=10)16.26±1.43#BAR中浓度预处理组(n=11)10.14±1.06#BAR高浓度预处理组(n=11)9.03±0.95△

注：与对照组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，△P<0.01

2.6 6组大鼠caspase-3、Bax/Bcl-2表达水平 结果显示，与对照组比较，模型组大鼠心肌组织caspase-3、Bax蛋白表达显著提高(P<0.01)，而Bcl-2蛋白表达显著降低(P<0.01)；与模型组比较，BAR组大鼠心肌组织caspase-3、Bax蛋白表达显著降低，并呈剂量依赖趋势(P<0.05)，而Bcl-2蛋白表达显著升高，也呈剂量依赖趋势(P<0.05)。见表5。

图1 流式细胞仪检测的各组心肌细胞凋亡率；A 对照组；B 模型组；C 阳性对照组；D BAR低浓度处理组；E BAR中浓度处理组；F BAR高浓度处理组

组别Akt蛋白eNOS蛋白对照组(n=12)100.0±5.42100.0±5.62模型组(n=9)35.23±2.02*58.32±2.35*阳性对照组(n=11)91.46±4.21△95.63±5.05△BAR低浓度预处理组(n=10)44.60±1.86#70.80±2.52#BAR中浓度预处理组(n=11)58.49±2.61△73.75±2.10#BAR高浓度预处理组(n=11)71.68±3.92△92.03±4.61△

注：与对照组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，△P<0.01

组别caspase-3蛋白Bax蛋白Bcl-2蛋白对照组(n=12)1.15±0.220.68±0.1615.01±1.28模型组(n=9)17.10±1.35*22.65±0.95*1.31±0.25*阳性对照组(n=11)4.38±0.65△6.52±0.3111.73±1.01△BAR低浓度预处理组(n=10)14.76±1.23#17.66±0.52#5.22±0.36#BAR中浓度预处理组(n=11)13.82±1.10#15.28±0.61△10.05±0.54△BAR高浓度预处理组(n=11)9.89±0.82△8.24±0.33△11.12±0.65△

注：与对照组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，△P<0.01

2.7 6组大鼠心肌组织形态结构比较 对照组组大鼠心肌纤维排列整齐，结构清楚，细胞无水肿，间质未见异常。模型组组大鼠心肌纤维断裂、排列紊乱，间质水肿，部分肌纤维坏死，明显炎性细胞浸润。阳性对照组大鼠心肌纤维断裂、排列紊乱程度较轻，间质未见明显异常。BAR低、中、高浓度组大鼠心肌纤维断裂、间质水肿、排列紊乱程度逐步减轻，炎性细胞明显减少。见图2。

图2 6组大鼠心肌组织形态结构(HE染色×400)；A 对照组；B 模型组；C 阳性对照组；D BAR低浓度处理组；E BAR中浓度处理组；F BAR高浓度处理组

3 讨论

MIRI是一种复合多种因素参与的复杂病理过程，再灌注后心肌细胞内钙超载、氧化应激损伤、炎性反应以及心肌细胞凋亡是MIRI发生的主要机制。MIRI后，再灌注后的心肌细胞分泌大量的炎性因子，如白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等，导致中性粒细胞被激活，不断向心肌细胞内趋化，从而产生大量自由基[7]。此外，被激活的氧自由基进一步诱导胞膜脂质过氧化、心肌酶外漏以及膜结构的破坏，从而增加心肌细胞膜的通透性，继而导致胞内钙超载对心肌细胞产生损伤[8]。并且，氧自由基及钙超载可导致线粒体通透性转换孔道(mPTP)增加，并释放细胞色素C(Cyt C)进入胞浆，干扰细胞能量代谢，促进心肌细胞凋亡[9,10]。本研究显示，MIRI后血清和心肌组织NO及总抗氧化能力(TAOC)水平显著降低，而BAR则能明显提高血清和心肌组织NO及TAOC水平。MDA是脂质氧化的最终产物，其含量高低反映体内氧自由基产生和释放水平[11]。SOD是细胞内主要的抗氧化酶，也是细胞内主要的自由基清除剂，其水平的高低，可反映出内源性氧自由基清除系统功能[12]。CAT可促使H2O2分解为分子氧和水，清除体内的过氧化氢，从而使细胞免于遭受H2O2的毒害，是生物防御体系的关键酶之一。GSH-px可催化过氧化氢分解，其表达水平的高低可间接反映机体清除氧自由基的能力[13]。研究显示，MIRI后心肌组织MDA含量增高，而CAT、SOD及GSH-px等抗氧化酶类消耗增加，使活性氧的生成和清除的平衡被打破，从而激发心肌细胞的脂质过氧化损伤[14]。本研究显示，MIRI后血清和心肌组织MDA含量明显提高，而CAT、SOD及GSH-px含量显著降低，BAR则能明显降低MDA含量，提高CAT、SOD及GSH-px含量，从而降低氧化应激水平。

心肌细胞凋亡在MIRI进程中最为严重的阶段，Bcl-2一种重要的抗凋亡蛋白，具有保护细胞生存并且不促进细胞增殖的特性，能通过线粒体膜抑制caspase-3和Cyt C的释放[15]。Bax是哺乳动物细胞内最主要的凋亡蛋白之一，其主要通过抑制Bcl-2活性而发挥促凋亡效应[16]，Bax可通过激活caspase-3，以及促进Cyt C释放，干扰心肌细胞能量代谢，导致细胞凋亡。目前认为，Bcl-2的表达可抑制多种因素引起的细胞凋亡，而Bax则主要通过抑制Bcl-2的活性发挥促凋亡效应。但二者表达处于相互拮抗的动态平衡，共同调节细胞的凋亡[17]。本研究显示，MIRI后模型组大鼠心肌组织caspase-3及Bax蛋白大量表达，Bcl-2蛋白显著降低，BAR则可显著抑制caspase-3及Bax，提高Bcl-2表达，从而降低MIRI后大鼠心肌细胞凋亡。

为了从分子水平探讨BAR对MIRI后心肌细胞凋亡的影响，本实验研究了BAR对MIRI后心肌Akt/eNOS信号通路的影响。研究显示，PI3K/Akt信号通路对MIRI的主要保护性信号通路之一。Akt是位于PI3K下游主要效应分子，Akt的磷酸化能对MIRI后心肌细胞产生保护作用[18,19]。NO可通过防止心肌细胞内钙超载、抑制mPTP开放而发挥抗凋亡作用，活化的Akt可激活eNOS，诱导NO通路对MIRI后心肌细胞凋亡产生抑制作用[20]。本研究显示，模型组大鼠心肌组织Akt及其eNOS磷酸化水平较对照组显著下降，提示MIRI后大鼠心肌组织Akt/eNOS信号通路受到明显抑制，NO含量也随之减少，而BAR预处理组中Akt及eNOS磷酸化水平显著提高，NO含量也叫模型组明显提高，提示BAR可能通过激活Akt/eNOS信号通路、增加NO合成而发挥MIRI后心肌保护作用。

综上，BAR可有效改善MIRI大鼠心肌损伤，其机制可能是通过激活Akt/eNOS信号通路，提高抗氧化能力，抑制心肌细胞凋亡有关。