中性粒细胞弹性蛋白酶及与疾病的关系研究进展

赵曰霞 邓莉

中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase，NE)是中性粒细胞分泌的主要丝氨酸蛋白酶之一[1]。NE在机体的生理和病理过程中具有重要作用，一方面NE参与构成机体防御系统，协助清除病原微生物；另一方面，NE过度激活，在与内源性抑制剂之间失衡的情况下，直接参与组织损伤,与多种炎症相关疾病，如动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)、慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)，肺囊肿性纤维化(cystic fibrosis，CF)等疾病的发生密切相关，可作为这些疾病的防治靶点。本文对 NE及其在相关炎症性疾病发生发展中的作用机制进行综述和探讨，以期为以 NE 为靶点的药物开发与应用提供新视野。

1 NE的基本特性

1.1 NE的结构 NE是一种可溶性糖蛋白,由218个氨基酸残基组成，其三维结构是2 个 β桶结构形成的折叠,而每个β桶结构又包括6个反向平行的β折叠。其催化活性位点由天冬氨酸(asparagicacid，Asp)、组氨酸(histidine，His)、丝氨酸(serine，Ser)组成，位于2个β桶结构的连接处。NE 还含有天冬酰胺(asparagine,Asn)109 和 Asn159 两个糖基化位点，S1位点是半球形和疏水的，在确定NE底物特异性中起重要作用。NE以无活性的酶原形式合成，经过广泛的蛋白水解加工和翻译后修饰，才能转化为它的成熟形式，含有4对半胱氨酸残基形成的4对分子内二硫键，以维系分子结构的稳定。

1.2 NE的分布与表达 编码NE的ELA2/ELANE基因(以前称为ELA2，新称为ELANE)在早幼粒细胞阶段中高度表达。ELA2/ELANE基因的表达主要在转录和翻译后水平上受到严格控制。中性粒细胞嗜苯胺蓝颗粒是NE的主要存储部位，NE还可存在于核膜[2]以及由细胞因子激活的细胞表面。未激活的中性粒细胞膜上也有 NE表达，活化的中性粒细胞膜表达的 NE(membrane-bound elastase,mNE)是未活化的20 倍[2,3]。此外，巨噬细胞、平滑肌细胞和肥大细胞也可表达NE[4]。巨噬细胞不仅在生理条件下表达NE，也可以在某些病理条件下诱导合成NE[4]。

当中性粒细胞被细胞因子、细菌脂多糖、细胞松弛素B、佛波醇酯、钙离子载体等激活时,NE分泌到细胞外，约10%的NE与质膜外表面相结合[5]。NE能结合在细胞膜上，主要与含硫酸软骨素和硫酸乙酰肝素的蛋白聚糖(HSPG和CSPG)的硫酸基团的静电相互作用有关[6]。当活化的中性粒细胞进入弹性蛋白酶依赖的程序性细胞死亡过程(NETosis)，其中NE易位至细胞核并与DNA和组蛋白蛋白质经历缩合[7]。见表1。

表1 NE的分布与表达

2 NE的生物学功能

2.1 NE的抗菌活性 NE通过细胞内和细胞外两条途径有效的杀死革兰阴性菌如大肠埃希菌、肠道沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌和福氏志贺菌等，但对革兰阳性菌作用不明显。NE与髓过氧化物酶和由NADPH氧化酶复合物产生的活性氧物质组合，直接细胞内杀死吞噬溶酶体中的吞噬细菌。 中性粒细胞胞外诱捕网络(neutrophil extracellular traps,NETs)是由中性粒细胞释放至细胞外的包含有NE在内的蛋白酶、DNA、组蛋白组成的网状结构，可以捕获并清除病原菌，从而防止进一步扩散[8]。NETs中的NE在细胞外通过降解细菌毒力因子发挥其对革兰氏阴性菌的抗菌活性。此外，NE表面所带的正电荷介导其与细菌膜紧密结合，进而抑制细菌蛋白质合成并诱导膜去极化和破坏，在细胞外抗菌活性中发挥重要的作用[6]。

2.2 NE降解多种组织蛋白 NE具有广泛的底物特异性，不仅能特异性降解弹性蛋白，还能降解粘连蛋白、层粘连蛋白、 Ⅰ～Ⅳ型胶原蛋白、Ⅵ型胶原蛋白、Ⅹ型胶原蛋白、钙黏蛋白、蛋白多糖等多种细胞外基质以及血浆成分免疫球蛋白。在一定条件下可能水解肺、动脉、皮肤、韧带等组织从而引起一系列疾病。

2.3 NE对炎症过程的调控作用

2.3.1 对细胞因子的加工作用:NE可激活和加工肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素-1(IL-1)、IL-6、IL-8等促炎细胞因子，其中IL-1成员包括IL-1β、IL-18、IL-33和IL-36细胞因子，而IL-1β和IL-18促进TNF-α和IL-6的释放，调节炎性反应。

2.3.2 对细胞受体的调控:NE可通过加工细胞受体调控细胞信号传导，在调节炎性反应中发挥一定的作用。NE 通过裂解蛋白酶激活受体(protease activated receptor，PAR)-1,解除凝血酶激活的钙信号，而这种 G 蛋白偏置信号能够调节内皮细胞屏障的完整性，诱导上皮细胞凋亡[9]；NE通过PAR-2依赖性机制诱导膝关节炎症和疼痛[10,11]；NE可以激活Toll样受体4(TLR4)，而TLR4是TLR家族的关键成员，可以诱导产生炎性物质；NE通过激活表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)参与TLR4的反式激活，其被NE激活后可上调IL-8的产生，在调控炎症过程中起重要作用[12]。

2.3.3 对其他物质的调控:NE通过激活基质金属蛋白酶2(MMP-2)、MMP-9以及使金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP-1)失活，使蛋白水解平衡向有利于基质分解的方向变化[13]。NE通过增加上皮细胞的MMP-2表达，可能导致CF中重构和炎性反应增加。MMP-9通过产生PGP和增加IL-8的趋化因子效力发挥促炎作用[14]，NE通过裂解活化MMP-9参与CF、COPD等炎症性疾病。TIMPs被认为是MMPs最具特异性的内源性抑制剂，NE通过特异性切割TIMPs使其降解失活，使MMPs/TIMPs失衡，进而导致炎症的加剧。NE激活钙蛋白酶，钙蛋白酶能够切割E-cad，干扰其细胞-细胞黏附功能，破坏上皮细胞，参与肺炎症和组织破坏性疾病[15]。NE可以切割和修饰某些低密度脂蛋白(LDL)，增强了动脉壁细胞(特别是巨噬细胞)对它们的摄取，导致细胞胆固醇积聚和泡沫细胞形成[16]。

从前述可知，HNE生物学功能广泛，可以通过不同的机制调节全身和局部免疫应答和(或)炎症，影响细胞和组织功能，参与相关疾病的发生发展。

3 NE抑制剂

3.1 内源性NE抑制剂 具有抗NE活性的内源性抑制剂包括α-1蛋白酶抑制剂(AAT，α1-PI)，elafin， SLPI，α2-巨球蛋白(alpha 2-macroglobulin，α2-M)和单核细胞NE抑制剂(MNEI或SerpinB1)。 NE的活性主要受AAT，Serpin B1和SLPI的调节。 AAT主要在肝脏中合成，但也在肝外组织和细胞中表达，包括支气管上皮细胞，单核吞噬细胞和中性粒细胞以及癌细胞,可以被活性氧物质(ROS)灭活，导致细胞外基质成分降解，与弹性蛋白酶依赖性组织损伤的加剧，细胞死亡和自身抗原的释放，炎症恶化有关[17-21]。SerpinB1 是由巨噬细胞、上皮细胞、中性粒细胞产生的一种 HNE 强效抑制剂。它不分泌到细胞外环境中，保留在细胞质和初级颗粒内。SLPI是可由上皮细胞，肥大细胞，中性粒细胞、巨噬细胞产生，是保守性NE抑制剂[10]。 SLPI在受到炎性刺激时上调，通过抑制丝氨酸蛋白酶来控制炎症，减弱单核细胞/巨噬细胞对LPS的反应，阻止转录因子NF-κB，防止细菌，真菌和病毒感染。Elafin的主要底物是NE和蛋白酶-3，通过竞争性紧密结合机制起作用。NE和elafin水平之间的不平衡与ARDS死亡率相关。SLPI和elafin被归类为报警抑制剂，因为它们是响应于细胞因子的释放而产生并直接释放到上皮细胞中，从而调节免疫应答和炎症过程[17]。α2-M 是大小为 725 kU的血浆糖蛋白，因其分子质量大，较难能到达炎症部位。它对酶抑制作用的发挥可能就局限于循环血液中，只有当血管通透性大大增加的时候才能游离到其他部位发生作用。

生理情况下NEI 和 NE 保持平衡状态，从而抑制 NE 对组织、细胞的损伤作用。但在炎症或感染时，NE也可通过有限的颗粒胞吐作用释放到细胞外。尽管细胞外存在内源性抑制剂，但 NE 释放到细胞外后仍然保持活性。NE 有多种机制抵抗内源性抑制剂的作用：(1)NE通过结合α-2巨球蛋白或聚阴离子结合配偶体(如硫酸乙酰肝素、NETs中的DNA)使其免受抗蛋白酶的作用[21];(2)中性粒细胞在活化后产生的大量氧自由基、MMPs可使 α1-PI、α2-M 失活[22]；(3)活化的中性粒细胞周围存在专性NE活性区域，其中释放的NE的局部浓度高于抗蛋白酶的表观浓度；(4)NE与其底物紧密接触，阻止 NEI 的抑制作用;(5)当细菌不能从CF患者的气道中有效清除，细菌蛋白酶可降解抗蛋白酶；(6)环境(烟草烟雾，空气污染)或遗传(AATD)因子可进一步降低患者的有效抗蛋白酶浓度。NE 和 NEI 的失衡在很多疾病的进展中具有关键作用。

3.2 外源性抑制剂 目前已知的只有两种药物可用于临床：Prolastin(纯化的a1-AT)，一种通过重组DNA技术合成的多肽药物，用于治疗a1-抗胰蛋白酶缺乏症(AATD)；另一种是非肽类低分子量化合物Sivelestat，属于第二代HNE抑制剂[17]。AZD9668 (Alvelestat,Astra Zeneca) and BAY 85-8501 (Bayer Health Care) 是两种有效的HNE抑制剂，分别属于第三代和第五代HNE抑制剂，最近已达到COPD、CF和BE临床试验水平的第二阶段[17]。AZD9668是人NE的可逆和选择性抑制剂，两项Ⅱb RCT研究了AZD9668对有症状COPD患者的恶化频率，症状，肺功能和炎症生物标志物的影响[23,24]。尽管有良好的安全性和耐受性数据，但两项试验均未显示任何阳性结果。AZD9668在CF的随机，双盲，安慰剂对照，平行组，Ⅱa期研究中进行了一系列测试，其有良好的耐受性并且显着减少了痰炎症生物标志物(IL-6，正常T细胞表达)以及减少了游离和总尿液desmosine(弹性蛋白降解的生物标志物)[25]。

4 NE与疾病

NE不仅直接降解组织蛋白，还通过调控炎性反应、免疫反应等多种机制，导致组织损伤和重构，参与 AS、COPD 和 PF 等多种疾病的发生发展。

4.1 AS AS是常见的慢性血管性炎症疾病，炎症、免疫反应在AS的形成及AS斑块进展为不稳定斑块的过程中发挥着关键性作用[26]。NE存在于AS斑块内[27],不仅直接降解细胞外基质，还通过诱导内皮细胞凋亡影响AS斑块的稳定性。弹性蛋白酶诱导自噬-凋亡形式的内皮细胞死亡的剂量和剂量依赖性方式，与C/EBP同源蛋白(C/EBP-homologous protein,CHOP)的磷酸化/表达的显着增加相关。Glinzer等[28]通过使用CHOP敲低，确定CHOP是弹性蛋白酶诱导内皮细胞死亡的关键介质。此外，NE还能促进泡沫细胞生成并增加局部/全身炎症。NE通过增强ATP结合盒转运蛋白ABCA1蛋白的降解来抑制胆固醇流出，增加巨噬细胞中脂质积累，促进泡沫细胞的形成。这反过来导致更高水平的局部和全身炎症，并最终增加动脉粥样硬化。NE缺陷小鼠中，多种促炎细胞因子(例如，TNF-α，IFN-c，IL1b，IL-8和IL-12)的循环和主动脉表达水平均显著降低，表明NE通过启动这些促炎性细胞因子促进AS形成[29]。NE被认为是AS的治疗靶点，可以用作早期AS病变的分子成像的特异性靶标[30]。总之， NE在AS的发病进展中所起的作用可能比预想的要大，NE可能作为 AS新的防治靶点。

4.2 慢性肺疾病

4.2.1 COPD：蛋白酶-抗蛋白平衡失调是COPD的主要致病机制，导致中性粒细胞和巨噬细胞的大量肺浸润，释放过多的NE。E-cad是维持上皮细胞-细胞间紧密黏附的关键蛋白，NE介导血管E-cad的降解，破坏上皮细胞，导致肺上皮破坏和损伤；此外，NE能特异性降解弹性蛋白。弹性蛋白被NE降解时产生片段EL-NE，被评估为与慢性炎症和肺气肿相关的生物标志物 NE除了降解组织蛋白外，它还能刺激黏液素的产生和分泌，从而导致COPD患者气道阻塞。COPD患者的血清NE水平以及痰NE水平均升高[31,32]。遗传因素 α1-PI缺乏增加了 COPD 发病的危险性，α1-PI 缺乏患者中，由于肺部的蛋白酶与其抑制剂失衡， 以NE为主的蛋白酶降解肺组织，导致肺气肿的发生。HNE水平升高与肺气肿的严重程度呈正相关 其机制是通过蛋白酶激活受体1(PAR1)切割。 另外，炎症过程可以通过NE切割中性粒细胞PAR2受体来激活[33]。

研究表明，胎盘生长因子(PGF)和PGF触发的下游信号分子介导NE诱导肺上皮细胞凋亡，同时NE可以增加PGF的表达，进一步加速肺细胞凋亡和肺气肿的发生发展[34]。

4.2.2 CF：CF是由囊性纤维化跨膜电导调节(CFTR)基因突变产生的疾病，以早发性气道黏液堵塞，自发性细菌感染，慢性炎症和结构性肺损伤为特征。NE是早期CF肺结构损伤的预测因子,是肺病严重程度的关键风险因素[36]。研究发现痰中性粒细胞的NE活性与CF患者的肺病严重程度相关[37]。即使在痰上清液中游离NE活性水平较低时，CF痰中性粒细胞表面的NE活性也一直在增加。进一步证明了表面NE活性与气流受限和肺恶性膨胀的肺功能指标相关。CF患儿的支气管肺泡灌洗(BAL)体液NE活性升高与结构异常(包括胸部CT发现的早期支气管扩张)的发生和进展之间存在很强的联系[37]。NE活性增加可通过CFTR的蛋白水解降解和ENaC的切割活化加剧碱性CF离子转运缺陷。体表上皮和黏膜下腺体的CFTR功能异常导致气道表面脱水和微酸性。这些缺陷导致黏液清除受损，抗菌肽减少细菌杀灭，从而为气道黏液堵塞和宿主防御受损奠定了基础，导致慢性中性粒细胞性炎症、感染的恶性循环。

4.3 其他疾病 最近一些研究也报道了NE参与银屑病、前粒细胞白血病、脊髓损伤、脑缺血、肥胖和胰岛素抵抗等疾病的发生发展[38-41]。银屑病和特应性皮炎患者在外周血中性粒细胞中显示过量的弹性蛋白酶，白细胞介素-36受体拮抗剂(IL-36Ra)与银屑病炎症相关，尤其是脓疱性银屑病亚型中的功能丧失突变[38-42]。NE通过将IL-36Ra切割成其高度活跃的拮抗形式参与银屑病炎症[41]。研究发现，NE可以激活白血病细胞中磷酸肌苷-3激酶/Akt信号通路，抑制细胞凋亡，促进细胞增殖，说明NE可能参与前粒细胞白血病[40]。通过遗传缺失或药理学抑制特异性靶向NE对于瞬时局灶性缺血以及创伤性和缺血性脊髓损伤的啮齿动物和兔模型具有急性神经保护作用，提示NE参与脊髓损伤、脑缺血。NE和A1AT的失衡通过AMPK通路的调节影响能量消耗，促进肥胖相关炎症、脂肪组织重构、胰岛素抵抗和肝脏脂肪变性的发生[38]。

5 NE相关疾病的治疗思路

正如前所述，NE 与很多疾病的发生发展相关，可能成为这些疾病的药物防治靶点．根据 NE的生物学功能与致病机理，笔者认为可以从以下几个方面着手：(1)抑制NE的生成：组织蛋白酶C(CTSC，syn.Dipeptidly-peptidase I)是一种广泛表达的NSPs 的激活剂，抑制CTSC 的活性能削弱 NSPs 的产生[43]。通过对内源性活化剂CTSC 的抑制，使中性粒细胞活化减少，从而减少NE的产生。现且已经发现一种能穿过细胞的无毒性CTSC 抑制剂，但这种抑制剂风险大，对多种蛋白酶的均有抑制作用[43]。(2)抑制NE分泌：抑制剂rBmTI-6-D1 PPE-肺气肿小鼠模型中抑制胰蛋白酶/激肽释放酶活性，可以干扰NE分泌[43]。(3)清除或减少NE抑制剂的内源性氧化剂和远离外源性氧化剂：上述我们已知 α1-PI 和 α2-M等可被多种内源性氧化剂和外源性氧化剂如烟草、化学试剂灭活，所以可通过清除或减少 NE 抑制剂的内源性氧化剂和远离外源性氧化剂来维持抑制剂的抑制作用，从而阻止疾病的发展。(4)设计针对于NE的不易被内源性物质氧化或降解的小分子特异性抑制剂。(5)联合治疗：对于COPD，除使用NE抑制剂外，还可以与其他疗法一起应用，例如DNA酶，黏液溶解剂和抗生素等[42]。慢性PA支气管感染是CF和支气管扩张持续的炎症触发的关键因素之一，所以可以联合抗PA的基础上使用NE抑制剂，从而阻止疾病的发展[43]。

6 问题与展望

NE 是中性粒细胞分泌的多功能丝氨酸蛋白酶，直接影响炎症的发生发展。本文综述了NE的生物学功能、参与相关疾病的机制及其作为疾病治疗靶点的前景。对于NE相关疾病的治疗，近年虽已研发出各种生物治疗药物，但疗效还有待进一步的临床观察和评估。因此，研发出高效、特异性的NE抑制剂对于NE 相关疾病的防治具有非常重要的价值。本文综述了NE及其与疾病之间关系，期望为NE相关疾病预防及治疗提供新的视野。