乳腺癌组织中人乳腺球蛋白(hMAM)表达的临床意义

刘雅萍，魏昌然，许兴超，李湘奇*

(1.山东第一医科大学(山东省医学科学院)，山东 泰安；2.山东中医药大学，山东 济南；3.山东第一医科大学第二附属医院，山东 泰安)

0 引言

近年来乳腺癌的发病率逐年上升，现已居于我国大中城市恶性肿瘤发病率首位，严重威胁我国女性的生命健康，且该疾病极易发生淋巴转移，癌细胞扩散速度快，部分患者入院诊断时已发展为癌症终末期，患者治疗投入大但收效甚微[1]。若能在研究中发现乳腺癌的诊断指标，对患者确诊、复查以及治疗效果的评价等方面均有较大的应用价值，目前临床检查中多以肿瘤标记物CEA、CA153 和CA125 等为重点，但检查结果并不理想[2]。为此，急需寻找灵敏度高的新的标志物。现以2017 年5 月至2019 年6 月来我院进行乳腺癌诊断和治疗的患者、及良性肿瘤患者为研究对象，对比癌症患者和良性病变患者病变组织中hMAM 的表达水平，评价hMAM 的表达对诊断乳腺癌的重要意义，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017 年5 月至2019 年6 月来我院进行乳腺癌诊断和治疗的患者80 例为观察组，患者的年龄范围为32-60 岁，平均年龄为(39.42±6.63)。80 例患者均为浸润型乳腺癌；临床分期[3]乳腺癌Ⅰ期18 例，Ⅱ期37 例，Ⅲ期21 例，Ⅳ期4 例；发生淋巴转移42例。同时间来院治疗的79 例乳腺纤维腺瘤的患者为对照组，患者的年龄范围为34-66 岁，平均年龄为(43.17±7.22)。本研究已获得医院伦理委员会的认可与批准，所有患者都签署了知情同意书。

1.2 主要试剂及仪器

AxyPrep 总RNA 小量制备试剂盒(美国Axygen 公司，货号：AP-UN-MS-RNA-50)；PrimeScript™ RT Master Mix 和SYBR®Premix Ex Taq™ II(大连宝生物工程有限公司，货号：RR036A、RR82LR)；苏木素伊红(HE)染色试剂盒(碧云天生物科技，货号：C0105)。

凝胶成像仪(英国UVItec 公司，型号：Alliance Q9)，电泳仪、电转仪、电泳槽(伯乐Bio-Rad，型号：BE6085)，生物组织自动脱水机(湖北孝感市宏业医用仪器有限公司，型号：TS-12U)，生物组织自动包埋机(湖北泰维科技实业有限公司，型号：TB-718D)，Ventana BenchMark XT 全自动免疫组化染色仪(罗氏公司，型号：NexEx IHC)。

1.3 方法

1.3.1 RT-PCR 检测

依据AxyPrep 总RNA 小量制备试剂盒说明书进行细胞总RNA 的提取。依据PrimeScript™ RT Master Mix 将mRNA 逆转录合成cDNA(反应条件：37℃孵育60min，85℃孵育5min，冰浴5min)。再 通 过PCR 扩 增 仪(美 国ABI 公 司，型 号2720 型)和SYBR®Premix Ex Taq™ II 试剂盒说明书要求，以cDNA 为模板，进行扩增：模板1μL、上游引物(10um·μL-1)1μL、下游引物(10um·μL-1) 1μL、2×Taq PCR Master Mix12.5μL、DDH2O 9.5μL，反应条件：94℃预变性5min 后变性30s，55℃退火30s，72℃延伸3min，扩增40 个循环后，72℃延伸5min，4℃保存。将β-actin 作为内参照。

1.3.2 免疫组织化学(IHC)检测

全部标本均经10%中性甲醛进行固定处理，并用石蜡进行包埋，制成微阵列芯片(孔径3mm，含40 个组织芯)4mm 切片；选用2 张用于IHC 染色，另选1 张用于HE 染色；通过磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照，严格按试剂盒说明书完成相应操作。

1.4 观察指标

RT-PCR 检测通过凝胶成像系统对结果进行分析，以目的基因与内参β-actin 的灰度值之比表示mRNA 转录水平。

IHC 检测以高倍镜观察下细胞浆、细胞膜存在棕色颗粒为hMAM 阳性定义结果，反之为阴性。随机选取高倍视野8 个，观察细胞的染色情况，若无显色记为0 分，淡黄色记为1 分，棕黄色记为2 分，棕色记为3 分。同时评价阳性细胞占总细胞数的百分比，阴性：0 分；阳性细胞在25%及以下记1 分；阳性细胞数在25%～50%之间记2 分；阳性细胞在50%～75%之间记3 分；阳性细胞在75%～100%之间记4 分。将阳性细胞的染色强度及其百分比得分相加，其中得分＜3 为阴性，≥3 为阳性[4]。

1.5 统计学方法

本研究结果采用SPSS 20.0 软件进行数据分析，对统计结果进行t 检验，数据以平均值±标准偏差()表示，对统计结果进行检验，记录值和P 值，P＜0.05 为结果具有统计学差异。

2 结果

2.1 2 组hMAM 阳性百分率结果及其mRNA 表达水平比较

RT-PCR 检测结果表明，观察组患者病变组织hMAM 阳性百分率、mRNA 表达水平明显高于对照组(P＜0.01)，结果详见表1，图1。

表1 2 组hMAM 阳性百分率及其mRNA 表达水平比较

2.2 乳腺癌组织中hMAM 阳性百分率与临床病理特征的关系

以患者的病理分型、病理分期、是否转移为研究指标，对乳腺癌患者机体hMAM 阳性百分率进行研究，结果表明，病理分期处于Ⅲ期～Ⅳ期的患者hMAM 阳性百分率稍高于处于Ⅰ期～Ⅱ期的患者，但结果无统计学意义(P=0.517)；另外，癌细胞发生转移后，hMAM 阳性百分率明显提高(P＜0.01)，详细结果见表2，图2。

表2 乳腺癌组织中hMAM 阳性百分率与临床病理特征的相关性

图1 乳腺癌组织及乳腺纤维腺瘤组织中hMAM 的蛋白表达(SP×200)

3 讨论

临床研究表明，乳腺癌易发于40～55 岁的中年女性，并且该疾病的发生可能与患者情绪状态、工作压力有关[5]。近年来，肿瘤标志物的研究逐渐增多，诊断乳腺癌的确切指标也越来越多的被发现，但随着时间的改变，乳腺癌的死亡率正逐年增高，成为威胁女性生命最主要的恶性肿瘤，原因主要是远处转移和肿瘤复发。仍需要发现新的有效敏感指标来指导提高乳腺癌的早期发现肿瘤的转移和复发，采取合理的诊断及治疗措施，以达到改善乳腺癌预后的期望。

图2 乳腺癌组织及乳腺纤维腺瘤组织中hMAM mRNA 表达

目前，有关hMAM 的表达水平与乳腺癌相关性的看法尚未明确，但有研究指出，乳腺癌组织中hMAM 的阳性百分率与其发展存在明显的相关性。研究表明，hMAM 与癌变有一定关系，参与了乳腺癌的发生和发展过程，说明在癌细胞分化的初期及晚期，hMAM 的作用极为重要；另外，hMAM 的表达率在低分化时显著高于高分化和中分化，表明hMAM 在癌细胞分化中后期时的作用更强[4]。有研究证实，hMAM mRNA 在乳腺癌原发灶中其表达水平明显高于正常乳腺组织，且hMAM mRNA 的表达与淋巴结转移相关，但其与组织学等级或临床阶段之间未观察到明显关联[6]。还有研究表明，hMAM mRNA 在乳腺癌外周血循环肿瘤细胞中表达水平明显高于乳腺良性肿瘤外周血中hMAM mRNA 的表达，并且其表达与肿瘤大小、肿瘤分期及有无远处转移有明显的相关性，但与年龄及有无淋巴结转移未见明显相关关系[7]。

本研究表明，观察组患者病变组织hMAM 阳性百分率、mRNA表达水平明显高于对照组；病理分期处于Ⅲ期～Ⅳ期患者hMAM阳性百分率稍高于处于Ⅰ期～Ⅱ期的患者，但结果无统计学意义；并且癌细胞发生转移后，机体hMAM 阳性百分率明显提高。

综上所述，PCR 技术和IHC 技术能快速定量检测组织中hMAM 的表达，其灵敏度和特异性高，为此可为乳腺癌的辅助诊断提供客观可靠的依据。但是可能由于样本量较小，虽然得出的结果与前人研究相符，仍无法确定乳腺癌组织中hMAM 的表达量是否真的与临床分期、有无远处转移等没有明确关系，仍需进一步的研究。