miR-133靶向NLRP3对小鼠Kupffer细胞炎性活化的影响*

徐秀亮， 杨江华， 盛皓宇， 梁曼曼， 陈 聪， 鲁 稻， 江启贵

（1池州市人民医院感染科，安徽池州247000；2皖南医学院附属弋矶山医院感染病科，安徽芜湖241001）

库普弗细胞（Kupffer cells，KCs）是肝脏中介导炎症反应的单核-巨噬细胞群，可吞噬异物，可生成炎症因子导致肝细胞损伤，其持续激活可促使非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）等发生［1］。而NAFLD可诱发肝脏脂肪变性和脂肪纤维化，最终导致肝硬化和肝癌，危害严重［2］。因此，减轻KCs介导的肝损伤可缓解疾病。微小RNA（microRNA，miRNA，miR）参与炎症、肝细胞损伤和肝纤维化等过程［3］，肝损伤和肝纤维化的乙型肝炎肝组织中miR-133高表达可能会介导慢性炎症影响疾病进程［4］，但miR-133在KCs中的作用尚未见报道。本研究通过分离小鼠KCs，并经脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导，探究 miR-133在KCs炎性活化中的作用。

材料和方法

1 动物

清洁级BALB/c小鼠，雄性，6～9周，体重（15～22）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号为SCXK（京）2017-0021，饲养条件：温度（21±1）℃、湿度（50±10）%，光照/黑暗（12 h/12 h），自由饮水饮食。

本实验经池州市人民医院动物伦理委员会审核并批准。

2 药品、试剂及仪器

LPS（货号为 L4391-1MG）购自 Sigma；miR-133 inhibitor NC、miR-133 inhibitor、miR-133 mimic NC、miR-133 mimic、Lipofectamine 2000、核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）3′UTR-WT和NLRP3 3′UTR-MUT均由广州锐博生物设计并合成；引物由上海生工生物有限公司合成。TIANscript RT Kit（货号为 KR104）和 miRNA First Strand cDNA Synthesis Kit（货号为KR211）购自北京天根生化科技有限公司；小鼠白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒、兔抗鼠NLRP3抗体、兔抗鼠含胱天蛋白酶募集结构域的凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain，ASC）抗体、兔抗鼠caspase-1抗体和兔抗鼠GADPH抗体均购自Abcam，货 号 分 别 为 ab9722、ab1793、ab214185、ab175449、ab1872和ab181602；双萤光素酶报告基因检测试剂盒（货号为D0010）由北京索莱宝科技有限公司生产。

实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）仪由ABI生产，型号为7500；全自动凝胶成像分析系统购自深圳市三利化学有限公司，型号为ZF-388。

3 方法

3.1 小鼠肝脏KCs的分离和培养 实验前DMEM培养液添加10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L链霉素混匀，置于4℃冰箱中制成DMEM完全培养液待用。采用胶原酶原位灌注加双层梯度离心法获得小鼠KCs［5］：麻醉小鼠分离消化肝脏，200目滤网过滤后加100μL PBS稀释，1∶1加50%等渗Percoll溶液（stock isotonic Percoll，SIP）制成25%SIP，150×g离心15 min，分层由上往下为细胞碎片层、25%SIP层、KCs层、50%SIP层和其它层，小心吸取KCs置于新的EP管中，PBS稀释，1 200 r/min离心5 min，沉淀为KCs。KCs置于DMEM完全培养液中，在37℃、CO2培养箱培养，细胞分离6 h后加碳素墨水（终体积分数为0.5%）再培养1 h，于显微镜下观察细胞吞噬情况。

3.2 细胞分组 将经鉴定正确的细胞培养至对数生长期，分为正常（control）组、模型（model）组、miR-133 inhibitor对照（miR-133 inhibitor NC）组、miR-133 inhibitor组、miR-133 mimic对照（miR-133 mimic NC）组和miR-133 mimic组。除正常组外，其余各组添加1 mg/L LPS诱导［6］，各组参照Lipofectamine 2000说明书分别转染miR-133 inhibitor NC、miR-133 inhibitor、miR-133 mimic NC和miR-133 mimic，培养24 h鉴定各组细胞中miR-133水平。

3.3 RT-qPCR法检测细胞中miR-133和NLRP3的mRNA水平 细胞培养24 h后，RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，miRNA First Strand cDNA Synthesis Kit、TIANscript RT Kit将其逆转录成第1链cDNA。miR-133的上游引物序列为5'-CAGCTGGTTGAAGGGGACCAAA-3′，下游引物序列为5'-GGTGGCTTATGTTTGTAATCCC-3′；U6的上游引物序列为5'-ATATGGACGCTTCAATT-3′，下游引物序列为5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；NLRP3的上游引物序列为 5'-GACCATCGGCCGGACTAAAA-3′，下游引物 序 列 为 5'-CTTGCACACTGGTGGGTTTG-3′；GAPDH的上游引物序列为5'-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3′，下 游 引 物 序 列 为 5'-CCCTAGGCCCCTCCTGTTAT-3′。RT-qPCR 体系：10 μL 2×SYBR qPCR Mix，1 μL cDNA（40 ng/L），上、下游引物（10μmol/L）各0.5μL，8μL ddH2O。反应条件：94℃120 s；95℃ 40 s，62℃ 35 s，共 45 个循环。2-ΔΔCt法计算miR-133和NLRP3相对表达水平。

3.4 ELISA检测细胞培养液中炎症因子IL-1β和TNF-α水平 鉴定成功各组细胞，收集细胞培养液，300×g离心5 min收集上清，分装置于4℃冰箱待用。严格按照小鼠IL-1β和TNF-αELISA试剂盒说明书检测上清液中IL-1β和TNF-α水平。

3.5 Westerm blot实验检测细胞中NLRP3、ASC和caspase-1蛋白水平 按3.2培养细胞并鉴定成功，每孔加200μL蛋白裂解液冰上裂解15 min，10 000×g离心20 min，上清为总蛋白。凝胶电泳分离蛋白质后转膜；5%脱脂奶粉室温封闭2 h；加入各种Ⅰ抗（抗NLRP3、ASC、caspase-1和GADPH抗体），4℃孵育过夜；加入相应Ⅱ抗，室温孵育1 h。DAB显色试剂盒避光显色，全自动凝胶成像分析系统拍照和定量分析。

3.6 双萤光素酶鉴定miR-133与NLRP3的靶向关系 用TargetScan查找NLRP3 mRNA的3′-UTR与miR-133结合位点。设计合成NLRP3的3′UTR-WT和 3′UTR-MUT，分别与 miR-133 mimic 或 miR-133 mimic NC共转染，双萤光素酶报告基因检测试剂盒检测各组萤光素酶相对活性。

4 统计学处理

采用统计学软件GraphPad Prism 8.0进行数据分析，计量数据以平均数±标准差（mean±SD）描述，两两比较采用SNK-q法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 LPS对KCs的影响

培养4 h的KCs呈圆形，细胞边缘有较强的折光现象；随着培养时间的延长，培养至24 h时KCs呈星形，细胞开始向周围伸展；培养至72 h时KCs呈长梭形，体积较24 h时较大，边界清晰，见图1A。细胞中可见大量黑色颗粒，该颗粒是添加碳素墨水后的碳颗粒，证明该细胞具有较强的吞噬功能，该细胞即为KCs，见图1B。与正常组相比，模型组细胞中miR-133水平降低（P＜0.05）；与模型组、miR-133 inhibitor对照组和miR-133 mimic对照组相比，miR-133 inhibitor组细胞中miR-133水平降低（P＜0.05），miR-133 mimic组细胞中miR-133水平升高（P＜0.05），见图1C。

2 miR-133在LPS作用于KCs后对炎症的影响

与正常组相比，模型组细胞中NLRP3 mRNA水平、培养液中IL-1β和TNF-α水平及NLRP3和caspase-1蛋白水平升高（P＜0.05）；与模型组、miR-133 inhibitor对照组和miR-133 mimic对照组相比，miR-133 inhibitor组细胞中NLRP3 mRNA水平、培养液中IL-1β和TNF-α水平及NLRP3和caspase-1蛋白水平升高（P＜0.05），miR-133 mimic组细胞中 NLRP3 mRNA水平、培养液中IL-1β和TNF-α水平及NLRP3和caspase-1蛋白水平降低（P＜0.05），见图2。

3 双萤光素酶验证miR-133与NLRP3的靶位点

TargetScan分析发现，NLRP3 mRNA 的 3′-UTR含有miR-133序列保守碱基。萤光素酶实验结果显示，与 miR-133 mimic NC+3′UTR-WT 组相比，miR-133 mimic+3′UTR-WT组细胞萤光素酶相对活性下降（P＜0.05），见图3。

讨 论

Figure 1.Influence of LPSon KCS.A：the shape of KCs（scale bar=100μm）；B：identification of KCs（scale bar=50μm；black arrows indicate carbon particles）；C：expression level of miR-133 in cells of each group.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs miR-133 inhibitor NCgroup；□P＜0.05 vs miR-133 mimic NCgroup.图1 LPS对KCs的影响

miRNA靶向mRNA参与炎症反应应用广泛，可直接降解靶基因mRNA或抑制靶基因翻译实现转录后的基因沉默［7-9］，其中miR-133属常见miRNA，包括miR-133a和miR-133b两个成员，miR-133a在肝纤维化中具有抗纤维化作用，对肝脏起保护作用［10］；在炎症诱导的大肠癌中表达下调，可能参与从肠道炎症到癌变过程［11］。miR-133b在肝癌中水平降低，在肝损伤期间产生新的肝细胞反应中起着作用［12］；在变应性鼻炎小鼠鼻粘膜中表达下调，上调miR-133b通过靶向NLRP3可改善鼻摩擦、打喷嚏的频率以及细胞因子TNF-α、IL-4、IL-5和IFN-γ水平从而缓解变应性炎症和过敏症状［13］。推测miR-133影响疾病发生。本研究显示，与正常组相比，模型组细胞中miR-133水平降低，提示miR-133在LPS诱导的KCs炎症中表达下调，可能参与NAFLD炎症及肝损伤过程，但其具体机制尚不清楚。与miR-133 inhibitor对照组相比，miR-133 inhibitor组细胞中miR-133水平降低；与miR-133 mimic对照组相比，miR-133 mimic组细胞中miR-133水平升高，本研究miR-133转染成功。miR-133转染情况不同，可能影响靶基因表达从而影响参与疾病反应。

NLRP3属目前研究较多的炎症小体，NLRP3炎症小体激活诱导肝脏炎症和纤维化的介质［14-15］，在LPS诱导的小鼠炎症性肝损伤中抑制NLRP3表达可降低肝脏中IL-1β、IL-18、IL-6和TNF-α水平，缓解炎症，减轻肝损伤［16］。本研究显示，与对照组相比，模型组细胞中NLRP3 mRNA和蛋白水平升高，提示LPS诱导可激活NLRP3，活化后的NLRP3发挥致炎作用。进一步研究TargetScan预测检测到NLRP3 mRNA的3′UTR含有miR-133序列保守碱基，萤光素酶实验验证miR-133与NLRP3存在直接靶向结合位点，miR-133可通过直接靶向NLRP3而发挥作用。NLRP3激活后募集ASC并活化caspase-1，进而发挥致炎作用［17］。caspase-1可促进分泌IL-1β和TNF-α的分泌，从而加重炎症反应［18］。IL-1β在NAFLD中高表达，高水平IL-1β可增加NAFLD实质损害和脂肪性肝炎［19］；抑制TNF-α可改善NAFLD肠道微生态系统，可能导致调节血糖，脂质代谢和保护肝脏免受NAFLD损害［20］。本研究表明，与对照组相比，模型组细胞中caspase-1蛋白水平及细胞培养液中IL-1β和TNF-α水平升高，炎症反应剧烈；降低miR-133水平可激活NLRP3，增加caspase-1活化，加重炎症反应；升高miR-133水平则降低炎症因子IL-1β和TNF-α各水平，减弱炎症反应，实现对KCs的保护。

综上所述，miR-133在KCs炎症活化中低表达，增加miR-133水平可通过靶向NLRP3减轻小鼠KCs炎症，实现对KCs的保护作用。本文首次证实miR-133在LPS诱导的KCs中低表达，高表达miR-133可通过靶向NLRP3发挥抑制炎症作用。但本文只在细胞水平上初步探讨miR-133在KCs中的作用情况，是否对临床是否有意义尚需深入研究。

Figure 2.The effect of miR-133 on inflammation of KCs after LPSinduction.A：the mRNA expression level of NLRP3 in cells of each group；B：the levels of IL-1β and TNF-α in cell culture medium of each group；C：the protein levels of NLRP3，ASC and caspase-1 in each group.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs miR-133 inhibitor NCgroup；□P＜0.05 vs miR-133 mimic NCgroup.图2 miR-133在LPS作用于KCs后对炎症的影响

Figure 3.Target relationship verification between miR-133 and NLRP3.A：TargetScan prediction results；B：luciferase experimental verification results.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs miR-133 mimic NC+3′UTR-WTgroup.图3 miR-133与NLRP3的靶向关系验证