急性腔隙性脑梗死病人血清miR-29c-3p水平与认知功能障碍的关系探讨

熊 英，但毕堂，何必华

许多病人在急性脑梗死后出现痴呆或认知障碍，急性脑梗死后认知障碍或痴呆的发生率因研究方法而有所不同[1]。多中心队列研究发现，血管性认知障碍的发生率为62.6%，血管性痴呆的发生率为12.7%[2]。急性脑梗死后认知功能障碍与不良预后有关，已经成为一个严重的社会和公共卫生问题。研究人员在寻找急性脑梗死病人认知障碍的早期预测指标，如老年、低教育水平、脑卒中前认知能力下降等是导致认知功能障碍的危险因素[3]。微小RNA(microRNA，miR)是一种长度为18～30个核苷酸的小型的非编码RNA，在疾病的发生和发展中扮演重要的角色[4]。miR调节功能障碍与许多疾病有关，包括癌症、急性心肌梗死和急性脑梗死等[5]。最近的研究表明，miR的血清水平可以用来诊断病症，如多发性骨髓瘤和急性心肌梗死[6-7]。然而，脑梗死病人血清miR-29c-3p的作用仍然不明确。因此，本研究通过分析不同程度认知功能障碍急性腔隙性脑梗死病人血清中miR-29c-3p水平及关系，为寻找可以评估急性腔隙性脑梗死病人认知功能障碍的潜在生物标志物提供依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2016年6月—2018年6月在我院神经内科住院且确诊为急性腔隙性脑梗死的病人155例。根据认知功能诊断标准将病人分为认知功能正常组(62例)、轻度认知功能障碍组(37例)、中度认知功能障碍组(30例)和重度认知功能障碍组(26例)。病例入选标准：①年龄≥18岁；②头颅 CT 或磁共振成像(MRI)证实为急性腔隙性脑梗死；③意识清楚，能配合检查；④发病时间<14 d。病例排除标准：①既往无脑和其他严重躯体疾病和精神疾病史；②焦虑抑郁障碍病人；③严重肝、肾、心系疾病病人；④其他病因导致的痴呆病人。详细记录现病史、既往史等临床资料。本研究获得医院医学伦理委员会批准，所有病人及家属对本研究知情并签署知情同意书。

1.2 认知功能的测定及评定标准 所有病人在入院后第1天用简易智力状态检查量表(Mini-mental State Examination，MMSE)测定认知功能。该量表包括以下7个方面：时间定向力、地点定向力、即刻记忆、注意力及计算力、延迟记忆、语言、视空间。测验成绩与文化水平密切相关，正常界值划分标准：文盲>17分，小学>20分，初中及以上>24分。27～30分为认知功能正常；<27分为认知功能障碍，其中21～26分为轻度认知功能障碍，10～20分为中度认知功能障碍，0～9分为重度认知功能障碍。

1.3 实时荧光RT-PCR(RTFQ-PCR)法检测血清中miR-29c-3p和信号传导及转录激活蛋白 mRNA的水平 所有病人于入院后第1天采集清晨空腹静脉血5 mL，加入TRIzol 1 mL后-80 ℃保存备用；取出后加TRIzol全血，根据RNA提取试剂盒(美国Invitrogen公司)操作说明书提取RNA，根据反转录试剂盒(大连TaKaRa公司)说明合成cDNA，根据SYBR Premix Ex Taq TM Ⅱ荧光定量PCR试剂盒(上海生工生物工程有限公司)说明进行聚合酶链式反应(PCR)扩增。miR-29c-3p物序列：上游引物为5′-CAAACAAAGGACCAAGAAATT-3′，下游引物为5′-UUUCUUGGUCCUUUGUUUGT-3′；信号传导及转录激活因子3(signal transducers and activators of transcription3，STAT3)物序列：上游引物为5′-AGAACTAGTGAGTGTTGGGTGAATCTG-3′，下游引物为5′-GTCAAGCTTCTATCACGTAAACTAGCC-3′；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)引物序列：上游引物为5′-TCCCATCACCATCTTCCAG-3′，下游引物为5′- GGTATCCATCGCCATGCTC -3′。反应条件为95 ℃ 30 s预变性、95 ℃ 5 s变性、60 ℃ 44 s，40个循环，61 ℃时采集荧光，用实时荧光定量 PCR仪检测其表达量，以GADPH作为内参，采用 2-△△Ct法计算mRNA 的相对表达量。

2 结 果

2.1 4组病人基本资料比较 4组性别、高血压和糖尿病比较差异无统计学意义(P>0.05)，年龄、饮酒和吸烟比较，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

表1 4组病人基本资料比较

与认知功能正常组比较，①P<0.05；与轻度认知功能障碍组比较，②P<0.05；与中度认知功能障碍组比较，③P<0.05。

2.2 4组血清miR-29c-3p和STAT3 mRNA表达比较 与认知功能正常组相比，各认知功能障碍组血清中miR-29c-3p mRNA相对表达量降低，STAT3 mRNA相对表达量增加，差异均有统计学意义(P<0.05)；随着认知功能障碍严重程度增加，血清中miR-29c-3p mRNA相对表达量降低和STAT3 mRNA相对表达量增加越明显，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

表2 4组血清miR-29c-3p和STAT3 mRNA表达比较(±s)

与认知功能正常组比较，①P<0.05；与轻度认知功能障碍组比较，②P<0.05；与中度认知功能障碍组比较，③P<0.05。

2.3 认知功能障碍危险因素的Logistic回归分析 以是否患认知功能障碍为因变量(认知功能正常=0、认知功能异常=1)，以miR-29c-3p、STAT3、年龄、性别、高血压、糖尿病、吸烟和饮酒作为自变量进行Logistic回归分析，筛选认知功能障碍的影响因素，结果显示，miR-29c-3p、STAT3、年龄进入回归方程，高miR-29c-3p为认知功能障碍的保护因素(OR=0.678，P<0.001)，高STAT3和年龄大是认知功能障碍的独立危险因素(OR=1.408，P<0.05；OR=1.226，P<0.001)。详见表3。

表3 认知功能障碍危险因素的Logistic回归分析

3 讨 论

血清学检测是一种理想的早期筛查手段，具有方便性、非侵入性和筛选大量人群的适宜性。同时，新一代测序技术的出现使得血清miR的检测更加方便和准确。哺乳动物中枢神经系统发育相对较晚，在此阶段，神经胶质细胞分化受到各种因素的严格控制[8]。miR通过调节目标基因的表达来发挥作用，在miR的3′-UTRs中，通过结合特定的序列来抑制miR的转录或促进miR的降解[9]。研究发现，在急性脑梗死病人的脑脊液中miR(包括miR-27a、miR-137、miR-181c、miR-146a、miR-155和miR-29c)的水平都发生了变化[10-12]。本研究使用在线软件来确认miR-29c-3p的直接目标可能是STAT3。同时采用HCTarget算法对预定的靶基因进行验证。此外，还发现miR和靶基因的调控网络。该网络包含miR-19b-3p、miR-29c-3p和STAT3。本研究发现，各认知功能障碍组血清miR-29c-3p mRNA水平低于认知功能正常组，STAT3 mRNA水平高于认知功能正常组。

在成人的大脑中，STAT3的激活可以在某些条件下观察到，例如面神经轴切开术，脑缺血以及脊髓损伤[13-15]。研究表明，STAT3激活可以促进神经祖细胞的神经胶质分化，抑制神经祖细胞的神经元分化。STAT3的激活会导致过度的神经胶质瘤，在脑梗死病人中也能观察到[16]。因此，假设miR-29c-3p可能通过调控STAT3表达参与脑梗死病人认知功能障碍的发生和发展。在对SH-SY5Y细胞的研究中发现， miR-29c-3p表达下调可以提升SH-SY5Y细胞STAT3的磷酸化水平，这表明STAT3可能是miR-29c-3p的直接目标基因[17]。同时对阿尔茨海默病病人脑脊液进行检测，发现miR-29c-3p的表达水平降低[18]。此外，动物实验表明，当miR-29c-3p上调时，阿尔茨海默病大鼠的认知功能得到改善[19]。本研究结果与上述研究结果一致。因此，表明miR-29c-3p可能通过调控STAT3的激活参与急性腔隙性脑梗死病人认知功能的发生和发展。

本研究发现miR-29c-3p的潜在靶基因是STAT3。同时miR-29c-3p的表达水平与认知功能障碍成反比。因此，血清中miR-29c-3p可作为急性腔隙性脑梗死病人认知功能障碍的非侵入性生物学标志物。但本研究只检测血清中miR-29c-3p和STAT3水平，并进行相关分析，存在一定的局限性。目前已经确定有9个miR与认知功能障碍有关[20]。同时，一些研究还报道轻度认知障碍病人血清中miR-137、miR-181c、miR-9和miR-29a等的水平较低，低于400拷贝，这些miR不能被用作生物学标记物。因此，需进行进一步的研究，以完善miR-29c-3p作为认知功能障碍生物学标记物的依据。

综上所述，血清中miR-29c-3p水平降低是急性腔隙性脑梗死病人认知功能障碍的危险因素之一，且与认知障碍的严重程度相关，有可能作为诊断急性腔隙性脑梗死病人认知功能障碍潜在的生物学标志物。但由于本研究样本量较小，没有研究其他miR在认知功能障碍的表达情况。