应用高分辨率熔解曲线方法鉴定三带 喙库蚊(双翅目：蚊科)*

滕新栋 程晓兰 陈晓光 贺 骥

(1. 青岛海关，山东青岛266071；2. 大连海关，辽宁大连 116000； 3. 厦门海关，福建厦门 361000)

三带喙库蚊Culextritaeniorhynchus是一种广泛分布于亚洲、地中海和非洲地区的蚊种(Patsoulaetal., 2017)，主要孳生在稻田、池塘等清洁静水中(Gratz, 2018)，喜吸动物血液，兼吸人血，能够携带和传播多种疾病(杨中华等, 2018)。三带喙库蚊是我国日本脑炎的主要传播媒介(Lietal., 2005)，从其体内分离到日本脑炎病毒的概率和最低现场感染率均较高(边长玲等, 2009)；在热带亚热带地区是基孔肯雅病毒的传播媒介之一(马素霞等, 2008)；三带喙库蚊还可携带Colti 病毒、盖塔病毒、Kadipiro 病毒等病原微生物(张海林等, 2005；翟友刚等, 2008；Sunetal., 2009)。鉴于三带喙库蚊的危害，准确快速的鉴定对预防和控制以三带喙库蚊为传播媒介的蚊媒传染病具有重要意义。

高分辨率溶解曲线通常与实时荧光 PCR 相结合，可以实时监测温度上升时双链 DNA 的解链过程，具有高特异性、高通量、高灵敏性、低成本、快速等优势，使其在物种鉴定方面得到快速发展(Kalivasetal., 2014；Chuaetal., 2015)。线粒体基因组广泛存在于蚊虫体内，本研究设计了多个线粒体基因组基因片段的扩增引物，普通PCR结果显示细胞色素氧化酶亚基Ⅲ(COⅢ)作为线粒体内膜蛋白质多聚体12个亚基之一的扩增结果较理想。本研究在普通PCR的基础上，以三带喙库蚊线粒体基因组COⅢ为靶基因，建立高分辨率熔解曲线方法，实现对三带喙库蚊样本，尤其是不完整样本、幼虫样本特异性的准确快速鉴定，为防控蚊媒传染病提供有效技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

对辽宁、山东和广东口岸捕获的三带喙库蚊、淡色库蚊Culexpipienspallens、致倦库蚊Cx.quinquefasciatus、白纹伊蚊Aedesalbopictus、埃及伊蚊Ae.aegypti、刺扰伊蚊Ae.vexans、骚扰阿蚊Armigeressubalbatus、背点伊蚊Ae.dorsalis、凶小库蚊Cx.modestus，利用《中国国境口岸医学媒介生物鉴定图谱》进行形态学鉴定。

1.2 主要仪器与试剂

罗氏lightCycler 480 II罗氏荧光定量PCR、LightCycler© 480 High Resolution Melting Master试剂盒(Code No.04909631001，Version 07)、TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0试剂盒(Code No. 9765)、Tissue lyser-24多样品组织研磨机(上海净信实业发展有限公司)。

1.3 核酸提取

使用Tissue lyser-24多样品组织研磨机研磨单只蚊类样本的后足。使用TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0试剂盒提取不同蚊种线粒体基因组DNA。每种蚊虫选择9只,共计81只，每只蚊虫均提取后足线粒体基因组DNA。

1.4 核酸扩增及体系优化

从Pubmed数据库中获得三带喙库蚊线粒体基因组COⅢ基因的基因序列，利用Premier 5引物设计软件设计特异性扩增引物，并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物：COⅢ-F：5′- C G A T G A G G A A T A A T T T T A TT -3′；COⅢ-R：5′-C A G T A A A G A A T A A A C T T T G AG -3′。PCR反应体系的优化：体系为30 μL，其中2×酶预混液为15 μL，每次试验固定其他加入量，分别做MgCl2(25 mmol/L)、引物(10 μmol/L)、模板DNA梯度实验，用无菌去离子水补足体积。根据各成分不同梯度所对应的最佳熔解曲线选择出最适合此实验的反应体系。

优化后反应体系为2×酶预混液为15 μL，(10 μmol/L)正向和反向引物各0.4 μL，模板2 μL，无菌去离子水9 μL，(25 mmol/L) MgCl23.2 μL，共30 μL。94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环；72 ℃ 5 min。同时扩增淡色库蚊、致倦库蚊、白纹伊蚊、埃及伊蚊、刺扰伊蚊、骚扰阿蚊、背点伊蚊、凶小库蚊，并设置阴性对照。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳验证后，送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

1.5 高分辨率熔解曲线

PCR结束后直接运行HRM程序：95 ℃变性1 min；40 ℃降温1 min；65～95 ℃连续升温(每次升温1 ℃，收集25个荧光信号)；40 ℃冷却10 s；使用LightCycler© 480 Gene Scanning Software 软件分析HRM曲线。

1.6 重复性检测

用建立的方法分3次，每次检测3只待测蚊虫线粒体基因组DNA，评价方法的重复性。

2 结果

2.1 COⅢ基因扩增结果

三带喙库蚊扩增出COⅢ基因片段(262 bp)(图1)。经生工生物工程(上海)股份有限公司测序后获得扩增片段的基因序列，运用Pubmed数据库的Nucleotide BLAST功能进行序列比对分析，显示三带喙库蚊(COⅢ KT852976.1)与形态鉴定结果一致。淡色库蚊、致倦库蚊、白纹伊蚊、埃及伊蚊、刺扰伊蚊、骚扰阿蚊、背点伊蚊和凶小库蚊以及阴性对照均未扩增出COⅢ基因片段。

图1 三带喙库蚊COⅢ基因片段PCR扩增Fig.1 PCR amplification of COⅢ gene fragment of Cx. tritaeniorhynchus 1：DNA分子量标准DL2000；2：三带喙库蚊；3：淡色库蚊；4：致倦库蚊；5： 白纹伊蚊；6：埃及伊蚊；7：刺扰伊蚊；8：骚扰阿蚊；9：背点伊蚊；10 凶小库蚊；11：阴性对照. 1: DNA marker DL2000；2: Cx. tritaeniorhynchus；3: Cx. pallens；4: Cx. quinquefasciatus；5: Ae. albopictus；6: Ae. aegypti；7: Ae. vexans；8: Ar. subalbatus；9: Ae. dorsalis；10: Cx. modestus；11: Negative control.

2.2 高分辨率熔解曲线分析

利用三带喙库蚊线粒体基因组COⅢ基因的引物进行PCR扩增，对其扩增产物进行高分辨率熔解曲线分析得到了荧光强度变化率—温度熔解曲线(图2)。使用基于COⅢ基因的高分辨率熔解曲线发现，三带喙库蚊有明显的熔解曲线，淡色库蚊、致倦库蚊、白纹伊蚊、埃及伊蚊、刺扰伊蚊、骚扰阿蚊、背点伊蚊和凶小库蚊以及阴性对照均无熔解曲线。

图2 三带喙库蚊线粒体基因组COⅢ 基因的高分辨率熔解曲线Fig.2 High resolution melting curve of COⅢ gene in mitochondrial genome of Cx. tritaeniorhynchus

2.3 高分辨率熔解曲线的重复性

用建立的方法重复检测提取的三带喙库蚊线粒体基因组DNA并进行PCR扩增，结果发现，3次实验获得的COⅢ基因熔解曲线走势差异较小，具有很好的重复性(图3)。

图3 三带喙库蚊线粒体基因组COⅢ基因 重复性检测的高分辨率熔解曲线Fig.3 High resolution fusion curve for the detection of COⅢ gene repeatability in mitochondrial genome of Cx. tritaeniorhynchus

3 讨论

本研究中设计的COⅢ基因特异性扩增引物在高分辨率熔解曲线的PCR阶段保证了扩增的特异性，在随后的熔解阶段仅三带喙库蚊有明显的熔解曲线，淡色库蚊、致倦库蚊、白纹伊蚊、埃及伊蚊、刺扰伊蚊、骚扰阿蚊、背点伊蚊和凶小库蚊以及阴性对照均未出现熔解曲线，可准确快速鉴定出三带喙库蚊。

蚊虫种类鉴定手段主要为针对成虫的形态学方法，对幼虫、蛹、不完整样本等鉴定有所限制(何江等, 2016)；捕获蚊虫种类众多时的工作量更是直线上升，并且需要较高的专业鉴定水平(方义亮等, 2013)。高分辨率熔解曲线作为一项新兴技术，在蚊类种类鉴定研究中得到了初步的应用。以骚扰库蚊Cx.pipipensmolestus、致倦库蚊和尖音库蚊指名亚种Cx.pipienspipiens为研究对象，设计的30对带有生物型特异SNPs的引物产生扩增，并通过检测2个基因的SNPs测试了高分辨率DNA熔解分析作为一种蚊类亚种鉴定方法，最终可确定这3个蚊类亚种(Kimetal., 2018)。Ajamma等(2016)发现高分辨率熔解曲线可区分2种伊蚊、5种库蚊和2种曼蚊，并且能够有效区分按蚊和库蚊属，以及鉴定关系非常紧密的亚种证实了高分辨率熔解曲线在蚊种鉴定中的作用。Kang等(2013)发现骚扰库蚊、致倦库蚊和尖音库蚊指名亚种在74.4～75.4 ℃均有各自特定的熔解温度，骚扰库蚊和致倦库蚊的熔解曲线峰形与尖音库蚊指名亚种相比差异明显，重复性高，说明高分辨率熔解曲线可用于分类鉴定部分尖音库蚊复合组。利用基于ATP6和Cytb基因的高分辨率熔解曲线能准确快速区分白纹伊蚊和埃及伊蚊，可作为白纹伊蚊和埃及伊蚊不完整样本的鉴定方法(滕新栋等, 2018)。Zianni等(2013)利用高分辨率熔解曲线鉴别冈比亚按蚊An.gambiae和阿拉伯按蚊An.arabiensis，两种蚊类13个SNPs的熔解曲线有差异，准确鉴定出两种蚊类。

本次研究共选择8种蚊虫作为三带喙库蚊的对照蚊虫，但仅有淡色库蚊、致倦库蚊和凶小库蚊为库蚊属，未设计与三带喙库蚊形态特征相近或相似的蚊虫作为对照，主要是因为在日常本底监测中未捕获其他种类蚊虫，这也是本研究在对照设计上的一个缺憾。目前研究显示，基于COⅢ 基因的PCR-HRM可准确快速鉴定三带喙库蚊，可作为三带喙库蚊相关标本特异性鉴定的手段，将有利于更好地预防和控制以三带喙库蚊为传播载体的蚊媒传染病。高分辨率熔解曲线技术作为蚊类分子鉴定手段在国内外研究不多，需要更加广泛的研究促进其在蚊类鉴定中的应用。