中哈边境阿拉山口口岸小型兽类感染 巴尔通体调查研究*

王 颖 王婕敏 万道正 慈 颖 曹晓梅 王 静 张晓龙**

(1. 烟台国际旅行卫生保健中心，山东烟台 264000； 2. 中国检验检疫科学研究院，北京 100176； 3. 湖南国际旅行卫生保健中心，湖南长沙 410100； 4. 凭祥海关，广西 凭祥 532600)

巴尔通体Bartonellaspp.是一类革兰氏染色阴性、营养条件要求苛刻、兼性细胞内寄生的需氧杆菌，广泛存在于巨大多样性的哺乳动物和节肢动物体内。20世纪90年代以来，巴尔通体引起的心内膜炎、心肌炎、脑膜炎、视网膜炎、淋巴结病等疾病日益增多(Gutierrezetal.，2015)，备受公共卫生关注。目前被正式命名的共有37种及亚种(Rubioetal.，2014;马洁琼等，2018)。已从鼠类动物分离出的巴尔通体有22种及亚种，其中7种可导致人类出现感染(Buffetetal.，2013)。2017—2019年，国内就有宁夏、福建、云南省剑川县、中山神湾港、绥芬河口岸、乌拉斯台口岸等地调查了鼠携带巴尔通体情况，阳性率为0.73%～55.91%(万道正等，2017；肖方震等，2017；张涛等，2017；田珊珊等，2018；曹晓梅等，2019；陈利伟等，2019；董珊珊等，2019)，总体来看，北方地区阳性率显著高于南方。

阿拉山口口岸北临哈萨克斯坦，位于第2座亚欧大陆桥的中段，是进出我国的“西桥头堡”口岸，平均海拔在200～340 m之间。口岸附近主要植被为以梭梭和蒿草为主的防风林和次生林，小型兽类相对丰富。近年来，对阿拉山口口岸小型兽类携带巴尔通体调查研究相对较少，本研究通过扩增巴尔通体枸橼酸合酶基因(gltA)调查了该口岸小型兽类感染巴尔通体状况及种类情况，并对阳性扩增产物进行序列测定和分析。

1 材料与方法

1.1 监测地点与监测方法

2018年7月，在新疆阿拉山口口岸(82°33′″50″E，45°10′ 7″N)区域开展监测活动，监测地点地形主要以沟壑或雨水冲击带为主，地面主要植被为梭梭树、蒿草。

依据病媒生物密度监测方法 鼠类(GB/T 23798—2009)夹夜法开展监测，每次布放鼠夹300只，连续布放3 d。捕获的小型兽类经形态学鉴定后，立即无菌操作摘取肝脏和脾脏置于冻存管中，-80 ℃短暂保存，干冰条件运至实验室。

1.2 试剂和仪器

EX-RNA/DNA病毒核酸提取试剂盒(西安天隆科技有限公司)，分子生物学相关试剂购自宝生物工程(大连)有限公司，高通量组织研磨器(Qiagen)，引物合成和序列测定委托北京擎科新业生物技术有限公司完成。

1.3 小型兽类脏器DNA提取

每组脏器样本被分成2份，1份-80 ℃保存备用，另1份剪碎置于2.0 mL离心管中并加入适量RNAse-free Water，使用高通量组织研磨器充分研磨，取200 μL研磨液提取核酸，因调查同时需要检测RNA病毒性疾病，该处选择了DNA、RNA共同提取的试剂。

1.4 目的片段的PCR扩增

采用巴尔通体属特异性引物(宋秀平等，2015)对枸橼酸合酶基因(gltA)的379 bp片段进行扩增。上游引物BhCS781.p碱基序列为5′-G G G G A C C A G C T C A T G G T GG-3′，下游引物BhCS1137.n碱基序列为5′-A A T G C A A A A A G A A C A G T A A A CA-3′。PCR反应总体积为50.0 μL，其中PrimeSTAR HS 25.0 μL，10.0 μmmol/L 上、下游引物各2.0 μL，核酸2.0 μL，Rnase-free Water 19.0 μL。阴性对照使用RNase-free Water 代替核酸作为模板同时进行PCR。扩增程序设定为：95 ℃ 2 min，48 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s；再94 ℃ 30 s，48 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，进行30个循环；72 ℃ 延伸5 min。取PCR产物5.0 μL用1.0%琼脂糖凝胶(加入GoodView)在100 V条件下电泳30 min后，凝胶成像系统观察电泳结果。电泳图谱中出现大小约379 bp条带的PCR产物经纯化后送北京擎科新业生物技术有限公司测序。

1.5 序列分析

测序结果去除引物片段后的有效序列后提交NCBI网站使用“Nucleotide BLAST”进行相似性比对。使用MEGA 7.0 软件构建系统发育树，分析并确认巴尔通体种类，使用SPSS 16.0 软件进行统计学分析，判断巴尔通体在不同宿主间携带率的统计学差异。

2 结果

2.1 小型兽类监测结果

应用夹夜法监测，有效夹数为886夹，小型兽类密度为8.5%，共3目3科7属8种共75只。其中，大沙鼠Rhombomysopimus29只，红尾沙鼠Merioneserythrourus15只，小家鼠Musmusculus15只，小林姬鼠Apodemussylvaticus13只，灰仓鼠Cricetulusmigratorius1只，刺猬Erinaceusamurensis1只，虎鼬Vormelaperegusna1只。种类及构成比大小依次为大沙鼠(38.67%)>小家鼠/红尾沙鼠(20.00%)>小林姬鼠(17.33%)>灰仓鼠/刺猬/虎鼬(1.33%)，其中大沙鼠为优势种类，占所有捕获种类的38.67%。

2.2 巴尔通体gltA基因扩增结果

提取的核酸使用巴尔通体属特异性引物BhCS781.p/BhCS1137.n扩增379 bp的枸橼酸合酶基因(gltA)片段。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳、测序及比对，共有7份样本获得阳性结果。阳性感染的鼠种有小家鼠、大沙鼠、红尾沙鼠和小林姬鼠4种(表1)。

表1 阿拉山口小型兽类巴尔通体感染情况Tab.1 Bartonella infection on small mammals at Alashankou Port

扩增巴尔通体gltA基因，感染阳性结果分别来自7只4种鼠类，分别为大沙鼠、小家鼠、红尾沙鼠、小林姬鼠，分别占该鼠种的10.34%(3/29)、13.33%(2/15)、6.67%(1/15)、7.69%(1/13)。灰仓鼠和刺猬、虎鼬等小型兽类未检出巴尔通体。本次监测的小型兽类巴尔通体感染阳性率为9.33%(7/75)，阳性编号BART 1～7。

运用SPSS16.0软件，使用Fisher′s确切概率法比较大沙鼠、小家鼠、红尾沙鼠、小林姬鼠4种鼠类携带巴尔通体情况。经统计分析，4种鼠类巴尔通体阳性率无显著性差异(F=0.674，P=1.000)。

图1 巴尔通体gltA 基因系统发育树Tab. 1 Phylogenetic tree of gltA gene in Bartonella

2.3 阳性测序及比对结果

使用巴尔通体属特异性引物BhCS781.p/BhCS1137.n扩增核酸样本的gltA基因，测序结果提交NCBI网站进行BLAST比对，共得到阳性序列7份BART1-BART7，序列号分别为MT438457-438463。7份巴尔通体阳性分别来自小家鼠、大沙鼠、红尾沙鼠和小林姬鼠4种鼠种(表1)。巴尔通体阳性分属4个种，分别为B.elizabethae、B.fuyuanensis、B.taylorii、B.grahamii，同源性在97%～99%之间，其中3个阳性样本为B.elizabethae。

从NCBI网站下载巴尔通体不同种的gltA序列，运用MEGA 7.0 软件构建最大似然法系统发育树(Maxmum likelihood tree)。图1可见，BART 1、2、5与B.elizabethae聚为一支，相似度分别为98.82%、98.53%、97.94%；BART 4、6与B.taylorii聚为一支，相似度分别为98.32%、96.94%，BART 3 与B.fuyuanensis聚为一支，相似度为98.92%；而BART 7与B.grahamii聚为一支，相似度为99.72%。

3 讨论

宿主感染巴尔通体后，巴尔通体首先在皮肤血管内皮细胞中进行繁殖，每隔一段时间，细菌释放进入血液并感染红细胞。随后巴尔通体随血液在肝脏和脾脏的血管内皮细胞定殖，引起宿主动物肝脾肿大。巴尔通体几乎可以累及所有的系统和器官包括心脏、肝脏、脾脏、骨骼、骨髓、淋巴、肌肉、软组织和中枢神经系统(李小丽等，2012)。

目前已从鼠类分离到的巴尔通体中有7种可致人类疾病，包括B.bacilliformis、B.quintana、B.henselae、B.elizabethae、B.clrridgeiae、B.vinsoniisubsp.Berkhoffii、B.grahamii、B.tribocorum(粟冬梅等，2004)。其中，B.elizabethae、B.grahamii和B.tribocorum3种鼠传巴尔通体是公认的人类致病菌，如B.elizabethae可引起免疫功能正常及免疫缺陷者的心内膜炎，常见损害部位为主动脉瓣、二尖瓣。对于确诊时已有严重的瓣膜损害，需进行瓣膜置换术(李小丽等，2012)。宋秀平等(2015)、凌锋等(2014)选取鼠肝和脾进行巴尔通体研究，而白瑛等(2002)使用鼠血进行gltA基因扩增首次证实了巴尔通体在云南鼠群中流行。

引物BhCS781.p/BhCS1137.n扩增gltA基因，为巴尔通体属水平特异性引物，在国内外巴尔通体调查研究中广泛应用(Houpikianetal.，2001; 粟冬梅，2004)，可区分与巴尔通体同源性较高的根癌土壤杆菌、布鲁氏杆菌。本研究应用该引物首次调查了阿拉山口口岸鼠感染巴尔通体状况，从捕获的75份小型兽类脏器中共检测到7份巴尔通体感染阳性，阳性率为9.33%，其中B.elizabethae、B.grahamii为鼠传人类致病性巴尔通体，主要宿主是大沙鼠、小林姬鼠、小家鼠等。有学者(尹小平等，2017)在阿拉山口口岸鼠体蚤中检测到巴尔通体阳性，分属3个亚种为B.rochalimae、B.grahamii和B.elizabethae，以大沙鼠和红尾沙鼠为主要宿主，两次独立调查的结果有一致性，认为阿拉山口口岸小型兽类携带多种人致病性巴尔通体。

人类可通过与携带巴尔通体的啮齿动物接触而感染致病，或伤口被鼠排泄物污染而感染，也可能由寄生在啮齿动物体表的媒介昆虫蚤、蜱、虱等叮咬后引起感染(Gutierrezetal.，2015；马洁琼等，2018)。有研究认为，蚤是传播巴尔通体的首要媒介(Gutierrezetal.，2015)，阿拉山口口岸以臀突客蚤Xenopsyllaminax、叶状切唇蚤突高亚种Coptopsyllalamelliferardua和后弯怪蚤Paradoxopsyllusrepandus为主要传播巴尔通体种类(尹小平等，2017)。调查结果提示，应通过灭鼠、灭蚤降低巴尔通体自然宿主或传播媒介密度，防止巴尔通体在国境口岸的传入传出，保障口岸卫生安全。

致谢衷心感谢“一带一路”重点口岸病媒生物集中专项监测项目，感谢阿拉山口口岸小组魏怀波、田丽、万道正等专家不辞劳苦连续开展监测工作；感谢乌鲁木齐海关曹竹亭、赵超杰、徐文杰、刘志杰、李鑫、赵远凤、齐欣煜等同志鼎力配合开展监测！