黄山粉蝇DNA条形码和形态鉴定*

聂国嫒 杨庆贵 何 江 胡双双 邓耀华 孙立新**

(1. 江苏省检验检疫科学技术研究院，江苏南京 210019; 2. 江苏国际旅行卫生保健中心， 江苏南京 210019; 3. 上海浦东国际机场海关，上海 201202)

丽蝇科包含丽蝇、迷蝇、鼻蝇、金蝇和伏蝇5个亚科，约有1 100余种，我国约有250余种(范滋德，1992；师鉴等，2005)。丽蝇科分布广泛，在干、湿、寒、热环境中皆有分布，甚至在南、北极区或数千米的高寒山区也有分布记载。其中丽蝇亚科中的粉蝇族Polleniini已知11属近100种，在我国已发现4属28种，分布于全北区、东洋区及澳洲区(范滋德，1997；冯炎，2004)。作者2018年4月在对江苏南京建邺区进行蝇类监测的过程中，捕获粉蝇属雄性成蝇2头。

病媒生物种类的鉴定以传统形态鉴定为主DNA条形码(线粒体细胞色素c氧化酶I基因，COI)为辅。但对于获得的卵、蛹、幼虫或重要鉴别特征损坏的成虫，DNA条形码技术对其种类鉴定具有重要的参考意义。因此DNA条形码数据库越完善对于病媒生物种属鉴定的参考价值越大。我国对粉蝇属DNA条形码的记录有粗野粉蝇Polleniarudis、伪粗野粉蝇P.pediculata、匈牙利粉蝇P.hungarica、游荡粉蝇P.vagabunda、长阳粉蝇P.labialis等(魏晓雅等，2016；杨庆贵等，2017；杜鹃等，2019)；其数量甚少。本文通过形态特征结合DNA条形码鉴定结果，鉴定采获蝇种为黄山粉蝇P.huangshanensisFanetChen, 1997。本研究补充了我国粉蝇属DNA条形码库，且以往资料显示江苏省没有该蝇类的相关纪录，为该属的区系及演化提供了重要的科学资料。

1 材料与方法

1.1 标本来源

标本成蝇2头，雄虫，为2018年4月于南京建邺区(北纬31°59'3"、东经118°43'49")的灌木丛处捕获。

1.2 仪器与试剂

体视显微镜(Stemi 2000)、Dneasy Blood and Tissue Kit(QIAGEN)DNA提取试剂、Axcel Advanced全自动核酸分析仪、QX DNA Size Marker 100～2 500 bp，Dneasy Blood and Tissue Kit(QIAGEN)，10×PCR buffer(无Mg2+)、MgCl2(25 mmol/L)、dNTP Mixture(各2.5 mmol/L)、Taq DNA聚合酶(5 U / μL)(TaKaRa)。

1.3 形态特征鉴定

对该蝇种的体长、头部、胸部、翅、足、腹部等形态特征进行观察记录(范滋德，1997)。

1.4 目的基因扩增

参照文献(Folmeretal., 1994)设计COI 基因扩增通用引物: LCO1490：5′-G G T C A A C A A A T C A T A A A G A T A T T GG-3′；HCO2198：5′-T A A A C T T C A G G G T G A C C A A A A A A T CA-3′。由南京锐真生物技术有限公司合成。用Dneasy Blood and Tissue Kit DNA提取试剂盒，按操作说明书要求提取蝇类的总DNA，置于-20 ℃备用。

在35 μL的体系中，10 × buffer 3.5 μL，10 μmol上下游引物各1.5 μL，dNTP 3 μL，DNA模板3 μL，Taq DNA聚合酶0.4 μL(5 U/ μL)，灭菌去离子水补足至35 μL。扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃终延伸10 min。PCR产物经Axcel Advanced全自动核酸分析仪检测得到750 bp左右的明亮单一条带的样本送往南京锐真生物技术有限公司进行克隆测序。

图1 蝇种形态特征图(♂ )Fig.1 The morphological characteristics of the flies(♂ )A. 背面观；B. 头部；C. 尾器侧面观.A. Dosal view；B. Anterior view；C. Male genitalia, lateral view.

1.5 序列分析

所得序列经BioEdit Sequence Alignment Editor V 7.1.9.0软件验证图谱为有效序列，根据峰图质量去掉两端引物，将正反向测序结果进行拼接得到全长为658 bp的有效长度序列，用DnaSP 5.0计算捕获蝇类COI的碱基组成。

将测定的序列在NCBI上通过BLAST程序进行序列同源性比较。用Mega 7软件对得到的序列及在NCBI中选取与捕获蝇类相似度较高的其他5种蝇种的COI基因片段，以家蝇为外群(表1)。采用邻接法构建捕获蝇类的(Neighbor-Joining，NJ)聚类树。

表1 捕获蝇类及外群种类列表Tab.1 List of the sample and outgroup species

2 结果

2.1 形态描述

黄山粉蝇P.huangshanensisFanetChen, 1997

雄性：足黑，转节黄，膝最末端黄。腹卵形，底色黑，覆有不规则棋盘状可变色金色粉被。肛尾叶略短于侧尾叶，侧阳体细直，侧突细长，呈S形弯曲，末端短于下阳体末端。下阳体末端扩大。其余该蝇种体长、头部、胸部、翅、足、腹部特征同《中国动物志, 昆虫纲. 第六卷, 双翅目, 丽蝇科》中黄山粉蝇记述。

观察标本：♂，2018年4月，聂国嫒采自南京，北纬31°59′3″、东经118°43′49″。

国内分布：北京，陕西(黄龙)，安徽(黄山，模式产地)，浙江(莫干山、天目山)，福建(黄岗山)。

2.2 PCR扩增

所扩增的蝇类COI基因的长度大约750 bp(图2)，与COI序列大小相似(Renaudetal., 2012)。

图2 捕获蝇种COI基因扩增产物电泳图Fig.2 The electrophoregram of COI genes for the flyM：Marker 100～2.5 kb; 1：为捕获蝇类；2：阴性对照；3：阳性对照.M：Marker 100～2.5 kb; 1：Sample captured; 2: Negative control; 3: Positive control.

图3 基于COI基因序列构建的NJ聚类树Fig.3 Neighbor-joining clustering tree based on COI

2.3 序列分析

测序后拼接获得截获蝇种的序列长度为658 bp，(G+C)含量为33.4%，(A+T)含量为66.6%，符合昆虫线粒体DNA中碱基(A+T)含量比碱基(G+C)含量高的相关研究结果(Riveraetal., 2009; Renaudetal., 2012)。

2.4 DNA条形码分析

NCBI Blast结果表明，与游荡粉蝇(登录号为：MG116827.1、 MG120878.1、 MG120403.1)的COI序列相似度均为90.73%。将测得的序列上传至GenBank，登记号为：MN688573。以家蝇为外群，选用Kimura 2-parameter 模型以邻接法构建聚类树。如下图3所示，捕获蝇类与游荡粉蝇遗传距离较近，聚成一支。再结合形态学特征鉴定其为黄山粉蝇。

3 讨论

《中国动物志 昆虫纲 第六卷 双翅目 丽蝇科》详细记录了黄山粉蝇的形态特征及其在国内的分布，但对于其DNA分子条形码未见相关报道。以往也没有相关文献报道黄山粉蝇的危害，对其生态习性的记载也不详，作者是在绿化建设完善的办公区域捕获该蝇种。有记载该属蝇类卵生，幼虫通常寄生于蚯蚓，也有寄生于鳞翅目的记录。3～10月份即可在户外捕获该属成虫，捕获的最高海拔可达2 500 m(范滋德，1992；Rognes, 1992；2010)。

随着贸易往来的频繁、交通的便捷、旅游的发展，货物、交通工具、人员及行李常会携带一些病媒生物，导致蝇类及其他一些病媒生物突破地理障碍，在新区域定殖并传播的概率增大。1958年首次在北美报道游荡粉蝇，到如今美国从东海岸到加拿大的不列颠哥伦比亚省南部都有其分布(Jewiss-Gainesetal., 2012)。本属蝇类部分种类携带大量的病原体，对人类的健康及疫病流行的威胁越来越大。有相关文献报道，本属中的粗野粉蝇大量聚集会提高病原体传播的潜在风险(Fauldeetal., 2001；魏晓雅等，2016；杜鹃等，2019)。由于对于黄山粉蝇的研究甚少，不可排除其存在的潜在危害。在今后的研究中将会完善黄山粉蝇的生态习性及危害作用，该种在江苏省首次发现，测序并上传了其DNA序列，完善了粉蝇属DNA条形码库。同时对蝇类的有效防治、控制疫情的扩散、防止物种入侵有着重要意义。