MTHFR基因多态性对宫颈癌吉西他滨新辅助化疗的效果及预后影响

李雪梅 吴利琼 张晓菊

宫颈癌(cervical cancer)是女性生殖道常见的恶性肿瘤，其发病趋势近年来呈年轻化[1]。诱发因素包括经济状况、营养、婚育情况、病毒感染等，其中高危型人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是宫颈癌病变的主要因素[2]。发展中国家宫颈癌发病率明显高于发达国家，且由于发展中及低收入国家宫颈癌筛查率低于发达国家，使得宫颈癌致死率高于发达国家[3]。目前宫颈癌的治疗根据FIGO分期不同而有差别[4]。新辅助化疗(neoadjuvant chemotherapy,NACT)为20世纪80年代兴起的新治疗手段，可用于局部晚期宫颈癌的治疗[5]。吉西他滨(Gemcitabine)作为新型抗代谢抗癌药，单独或与其他抗肿瘤药物联用作为新辅助化疗方案对多种肿瘤具有较好的疗效[6]，在宫颈癌的新辅助治疗中也取得良好疗效[7，8]。然而临床应用中仍有部分患者对吉西他滨化疗具有耐药性，从而降低了化疗的疗效及预后[9]。因此寻找合适的生物标记物评估患者预后，对宫颈癌个体化治疗，临床方案制定指导具有重要价值。亚甲基四氢叶酸还原酶(5,10-methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)是叶酸活化过程中起着重要作用的关键还原酶，有研究报道MTHFR单核苷酸多态性与多种肿瘤如乳腺癌、结肠癌、口腔鳞癌等的发生发展密切相关[10-12]。研究发现MTHFR基因多态性也与宫颈癌的发生密切相关，其中MTHFR1298和MTHFR667是宫颈癌患者常见的突变位点[13，14]。本文分析MTHFR1298和677两位点基因多态性对宫颈癌患者经吉西他滨化疗后疗效及预后的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2013年5月至2015年4月于我院就诊接受吉西他滨化疗的宫颈癌患者58例，搜集分析2组患者的年龄、分化程度等临床病理资料。本研究经医院伦理委员会批准，所有患者对本研究知情且签署知情同意书。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准：①患者经病理活检确诊为宫颈癌；②治疗前患者未接受其他放化疗；③年龄20～80岁；④临床病病理资料完整。

1.2.2 排除标准：①合并其他恶性肿瘤的患者；②患有精神疾病或认知功能障碍的患者；③组织量不足而影响基因型分析的患者。

1.3 方法 患者均给予静脉滴注吉西他滨(泽菲，江苏豪森药业股份有限公司)1 000 mg/m2，30 min滴注完毕，21 d为1个疗程，共治疗2个疗程。每个疗程结束后7～10 d对疗效进行评估，如化疗有效则继续下1个疗程的疗效，如无效或进展者则根据病情行手术治疗或放化疗。

1.4 检测方法 (1)石蜡组织DNA提取：根据石蜡包埋组织DNA提取试剂盒(宁波市重鼎生物技术有限公司)说明书流程提取DNA。(2)PCR扩增：根据不同引物的进行扩增，反应体系包括10 μl 2×Taq Master Mix，1 μl引物，0.4 μl探针，8.6 μl DNA。反应经40个循环，每个循环为95℃ 3 min，95℃ 12 s，62℃ 40 s，95℃ 12 s。(3)酶切反应：扩增后分别用限制性内切酶进行酶切反应，反应体系包括4 μl 5×Reation Buffer，1 μl限制性内切酶，6 μl PCR纯化产物，9 μl高压Free dH2O。其中MTHFR1298使用MboⅡ内切酶，MTHFR667使用HinfⅠ内切酶。(4)选取适合PCR产物大小的琼脂糖凝胶浓度，将配置好的琼脂糖溶于Tris/Borate/EDTA(TBE)缓冲液中，加热使之澄清透明。待溶液冷却后加入凝胶染料，随后将凝胶溶液倒入胶膜，梳尺固定并取出凝胶后置于琼脂糖凝胶电泳仪中，上样，于150 V电压下常温跑电泳30 min，并用凝胶成像仪观察结果。见表1。

1.5 近期疗效评价 化疗停止后根据实体瘤疗效评价标准15对患者进行疗效评价，疗效分为4个等级：完全缓解(CR)： 肿瘤消失; 部分缓解(PR):肿瘤体积减小占比>30%；疾病稳定或无变化(SD)：肿瘤体积减小占比<30%或增大占比<20%；进展(PD)：肿瘤体积增大占比>20%；其中总有效率为CR+PR。

表1 PCR引物序列和限制性内切酶类型

1.6 随访 宫颈癌患者化疗结束后分别于3个月、6个月1年来院复查，包括患者的阴道细胞学检查、盆腔检查、影像学及肿瘤标志物检查。随后进入生存随访阶段，每3个月的电话随访，记录患者的身体状况及是否复发，患者死亡为随访终点。随访截止时间为2018年6月，末次随访仍存活的患者以结尾值计算，随访期间失访以删失处理。共3例患者失访。

2 结果

2.2 MTHFR 1298A/C和667C/T基因型频率 MTHFR 1298A/C位点的AA、AC、CC基因型频率分别为46.5%、25.9%、27.6%；MTHFR 667C/T位点的CC、CT、TT基因型频率分布为56.9%、29.3%、13.8%。见表2。

表2 MTHFR 1298A/C和667C/T基因型频率 例(%)

2.3 MTHFR基因多态性与宫颈癌临床病理特征的相关性 患者的年龄、病理类型、分化程度均及淋巴结转移与MTHFR 1298和677两位点的基因型无关，而患者的肿瘤分期仅与MTHFR 677位点的基因多态性相关(P=0.026)，与MTHFR 1298位点的基因多态性无关(P> 0.05)。见表3。

表3 MTHFR 1298和677基因多态性与临床病理间的关系 例

2.4 MTHFR 1298和677基因多态性与近期疗效间的关系 患者治疗3个月时的疗效显示，总有效率为31.0%，进一步分析疗效与MTHFR 1298和677位点基因多态性的相关性，患者接受吉西他滨化疗后的短期疗效与MTHFR两位点的基因多态性均不相关(P>0.05)。见表4。

表4 MTHFR 1298和677基因多态性与近期疗效间的关系 例

2.5 MTHFR 1298和677基因多态性与远期疗效间的关系 在随访过程中，有3例患者因更改联系方式而失访。剩余55例患者中，有22例患者在随访过程中因宫颈癌进展和复发而死亡，患者3年总体无病生存率为49.1%，总生存率为60%。患者死亡为随访终点，失访患者为删失数据(3例)。用Kaplan-Meier 单因素生存曲线分析宫颈癌患者无病生存率和总生存率与MTHFR 1298和677基因型分布情况、临床病理参数间的关系，log-rank 检验分析患者各因素的统计学差异。宫颈癌患者无病生存率和总生存率与MTHFR 1298和677位点基因多态性及临床病理间的关系分析显示，MTHFR两位点的基因多态性、临床病理特征与患者的长期预后无显著相关(P> 0.05)。见表5。

3 讨论

由于宫颈癌具有较高的易感性，其在女性中的发病率一直居高不下，严重影响着患者的生活。放化疗作为宫颈癌的主要治疗方案，虽具有较好的疗效，但仍有部分患者出现化疗药耐药现象。吉西他滨作为去氧胞苷的类似物，可通过抑制核糖核苷还原酶而阻止DNA的修复和合成，进而抑制细胞复制，最终达到抗肿瘤的效果[15,16]。Swisher等[8]研究报道每周在顺铂和盆腔放疗中加入低剂量的吉西他滨可提高疗效。刘桂军等[6]报道吉西他滨联合顺铂新辅助化疗非小细胞肺癌，可能诱导TXNIP 基因mRNA的表达，使TXNIP 蛋白表达水平上调，从而加强其对TrxR 的抑制，进而对硫氧还蛋白清除活性氧能力产生抑制了作用，最终达到肿瘤生长抑制作用。此外，胡旻等[7]通过使用吉西他滨联合顺铂作为新辅助化疗方案治疗宫颈癌患者发现，该方案相较于系列霉素和顺铂化疗方案具有更好的额临床疗效。而然而，近年来研究发现部分宫颈癌患者对吉西他滨具有耐药性，该耐药性与介导吉西他滨摄入的人平衡核苷转运蛋白1(human Equilibrative Nucleoside Transporter 1，hENT1)有关，在耐细胞中(CaLoGR)hENT1表达下调[9]。

遗传易染性作为宫颈癌发生的内源性因素，其与患者接受化疗后的疗效及预后可能相关。MTHFR作为叶酸代谢中不可或缺的酶，具有活化叶酸的功能。叶酸与肿瘤的发生息息相关，当叶酸摄入不足导致水平较低时，肿瘤发生率增加。其可能是因为体内低叶酸水平导致DNA中尿嘧啶的错误插入和基因组DNA的低甲基化，进而导致基因组的不稳定性和肿瘤的发生[17]。MTHFR常见的基因多态性有1298A/C和677C/T两种，研究显示，MTHFR 677位点C突变到T，或1298位点A突变到C时，DNA甲基化、合成及修复受阻，从而可能成为宫颈癌发生的易感因素[18]。基于此，本文对MTHFR基因多态性及其与吉西他滨化疗疗效及预后的相关性做了分析。研究结果显示，MTHFR 1298A/C位点的AA、AC、CC基因型频率分别为46.5%、25.9%、27.6%；MTHFR 667C/T位点的CC、CT、TT基因型频率分布为56.9%、29.3%、13.8%。MTHFR 1298A/C位点和677C/T位点基因多态性与临床病理关系分析显示仅MTHFR 667C/T的基因多态性与患者肿瘤分期相关，而MTHFR 1298A/C位点和677C/T位点与患者的年龄、病理类型、分化程度及淋巴结转移均无显著相关(P> 0.05)。Jae等[19]报道当MTHFR 667C/T位C突变到T时，其编码的丙氨酸将被缬氨酸替代，从而降低MTHFR催化活性，影响叶酸的正常生理功能，从而引发DNA甲基化异常和DNA修复受阻，最终导致肿瘤恶化，临床分期升高。与本文结果一致，提示MTHFR 667C/T位点的基因多态性为肿瘤分期的判别提供了参考。

表5 MTHFR 1298和677基因多态性及临床病理与生存率间的相关性 例(%)

进一步分析MTHFR 1298A/C位点和677C/T位点与吉西他滨化疗疗效和预后的关系表明，MTHFR两位点的基因多态性与近、远期疗效均不相关。MTHFR的多态性与肿瘤发生、进展间的关系是当前的研究热点，然而其与肿瘤间的相关性仍无明确定论。Nemah Awwad等[20]报道MTHFR 677C/T位点的基因多态性与乳腺癌的发生相关，而1298A/C位点与乳腺癌无关。Gonzales等[21]则表明MTHFR 677C/T和1298A/C位点基因多态性对乳腺癌易染性的影响因地区而异，在澳洲、东亚、中东、南欧、摩洛哥和美国MTHFR 677 TT突变型可导致较高的乳腺癌发病率，而在亚洲、中东、南欧、南美等地则MTHFR 1298 CC突变型对乳腺癌的易染性影响较大。MTHFR基因型对宫颈癌的影响与之类似，Gong等[14]发现MTHFR 677位点的基因多态性与宫颈癌的发生无关，1298位点的基因多态性则与宫颈癌密切相关。然而，Lambropoulos等[22]却阐明MTHFR 677位点基因多态性与宫颈癌病变无关。该差异可能与所选择的地区、人种有关。

综上所述，MTHFR 1298和677位点的基因多态性与宫颈癌患者接受吉西他滨治疗后的疗效及预后均无显著相关性。但本文仍存在样本数较少，取样多样性欠缺等局限，故需大样本、多地区、多民族、长期试验进行验证。