DK-β、Lgr5和mTOR/P70s6k在胃癌中的表达及对预后的预测价值

付汉东 寇继光 刘汉中 阳仕雄 张爱华 胡校云 沈婷 魏威

胃癌是临床常见的恶性肿瘤之一，美国癌症协会(ACS)在2014年胃癌的发病率与死亡率的相关研究指出，虽然整体的胃癌的死亡率有下降[1]，但是胃癌的发病率呈现上升的趋势，全世界每年大约有近90万人死于胃癌相关疾病[2]。胃癌的高发率与近年人们饮食习惯、环境因素、遗传因素等都有一定的关系。目前临床对于胃癌的治疗手段包括手术根治术、放化疗、基因靶向药物治疗等，但是胃癌发病早期患者不重视，大多数确诊患者均为中晚期，已经错过最佳的手术时间。近年靶向药物治疗成为研究热点，而靶向药物治疗针对主要有以下几个药物作用靶点：G 蛋白耦联受体5是富含亮氨酸重复系列(Leucine-rich repeat G protein-coupledreceptor 5，Lgr5)，是干细胞分子标志物，在Wnt信号通路起到靶基因作用，临床其特性具有较强的自我更新能力[3]；雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是一种对细胞的生长、增殖非常关键的调节分子，同时在激活后的mTOR蛋白，对p70S6激酶(P70S6kinase,p70S6K)有磷酸化作用，对肌动蛋白的细胞迁移，细丝重构有推动作用[4]；Dermokine(DK)是上皮细胞角化后分泌的一种多肽，主要为缩氨酸，目前研究显示DK至少有13种不同的亚型，DK-β是其中一种[5]。本研究通过收集胃癌患者癌组织和癌旁组织样本，检测上述靶向药物作用相关靶点蛋白，探讨这些蛋白的表达与胃癌发生、发展以及治疗预后的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2016年6月至2018年6月收治的85例胃癌患者为研究对象，并选取同期80例非胃癌的患者为对照组，2组患者的基本信息比较差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准：胃癌患者均术前实施胃镜检查并取病理组织确诊，术后留取癌组织以及癌旁组织；胃癌患者实施手术治疗前未经化疗、放疗等相关干预手段；术前无其他相关脏器原发性肿瘤；研究对象均知情且同意；患者病历资料完整；经医院伦理委员会同意。

1.2.2 排除标准：患者术前经相关治疗；伴有其他脏器严重病变疾病；妊娠、哺乳期女性。

1.3 方法

1.3.1 标本收集:胃癌患者均经胃镜及病理组织确诊并实施手术治疗的患者，取患者胃癌组织及癌旁组织(距病灶边缘>5 cm位置)为标本，同时对对照组患者在胃镜检查时采集的胃黏膜正常组织为标本；以上所有病理组织在-80℃保存。

1.3.2 仪器与试剂:反转录试剂盒，总RNA提取试剂盒，基因试剂盒，琼脂糖，Taq DNA聚合酶，兔抗人mTOR,Lgr5,P70s6k,DK-β多克隆抗体,羊抗兔IgG，生物组织快速脱水仪，显微镜，凝胶成份分析仪，高速低温离心机，乙醇等。

1.3.3 方法：实施Trizol方法对组织RNA提取，然后进行扩增和电泳，进行RT-PCR指标检测。采用免疫组织化学Envision法进行检测DK-β、Lgr5和mTOR/P70s6k在胃癌中的表达。

1.4 观察指标 RT-PCR法对DK-β、Lgr5、mTOR、P70s6k在不同病理组织的相对表达情况比较；DK-β、Lgr5、mTOR、P70s6k在3组组织中的表达情况，与胃癌患者临床特征关系以及患者生存评估。

1.5 判定指标 DK-β染色阳性为细胞核染色，颜色反应深黄色、棕褐色，背景蓝色，颗粒状；Lgr5染色阳性为细胞核染色，颜色深黄色，棕褐色；mTOR染色阳性为细胞质染色，颜色深黄色、棕褐色；P70s6k染色阳性为细胞质或者细胞核染色，颜色反应深黄色、棕褐色[6]。随机选取每隔染色片10各视野进行阳性细胞率的计算，染色气强度记录浅黄色为1分，黄色为2分，深黄色、棕褐色为3分；阳性细胞百分比记录，<25%为1分，25%～50%为2分，51%～70%为3分，>70%为4分；染色轻度与阳性细胞百分比<2分为阴性(-)，2～4分为(+)，5～6分为(++)，>6分为(+++)[7]。

2 结果

2.1 RT-PCR方法对DK-β、Lgr5、mTOR、P70s6k在不同病理组织的相对表达情况分析 DK-β、Lgr5、mTOR、P70s6k在胃癌组织中的相对表达指标明显高于癌旁组织及其对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。DK-β、Lgr5、mTOR、P70s6k在不同病理组织的相对表达情况呈正相关性(P<0.05)。见表1，图1。

2.2 DK-β、Lgr5、mTOR、P70s6k在3组蛋白中的阳性表达情况比较 Lgr5、mTOR/P70s6k在3组组织中的阳性表达胃癌组织阳性率，明显高于癌旁组织以及对照组；3组组织中，DK-β阳性率的表达中癌旁组织的阳性率较胃癌组织以及对照组比显著增高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表1 RT-PCR对DK-β、Lgr5、mTOR、P70s6k的m-RNA在胃癌中表达相对表达情况比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与癌旁组织比较，#P<0.05

图1 DK-β、Lgr5、mTOR/P70s6k在胃癌组织、癌旁组织、正常组织中的表达;A、B、C是DK-β在胃癌组织、癌旁组织、正常组织中的表达；D、E、F是Lgr5胃癌组织、癌旁组织、正常组织中的表达；G、H、J是mTOR/P70s6k在胃癌组织、癌旁组织、正常组织中的表达(HE×400)

表2 DK-β、Lgr5、mTOR、P70s6k在3组蛋白中的阳性表达情况比较 例(%)

注：与对照组比较，*P<0.05；与癌旁组织比较，#P<0.05

2.3 DK-β、Lgr5、mTOR/P70s6k在胃癌中的阳性表达与胃癌患者临床特征关系 DK-β、Lgr5、mTOR/P70s6k的阳性表达与胃癌患者年龄、性别灌洗比较差异无统计学意义(P>0.05)。DK-β在胃癌患者肿瘤直径大小阳性率的表达差异无统计学意义(P>0.05)。Lgr5、mTOR/P70s6k阳性率的表达在胃癌患者肿瘤直径<5 cm(60.41%，58.33%，56.52%)与直径≥5 cm的阳性率(86.48%，75.68%，72.97%)比较差异有统计学意义(P<0.05)。DK-β、Lgr5、mTOR/P70s6k在TNM分期，组织学分级，淋巴转移情况比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

2.4 DK-β、Lgr5、mTOR/P70s6k不同阳性表达强度与患者生存分析 Lgr5、mTOR/P70s6k的高表达患者的3年生存率以及生存时间较低表达比较差异有统计学意义(P<0.05)。DK-β在对患者预后的评估高表达与低表达差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表3 DK-β、Lgr5、mTOR/P70s6k的阳性表达与胃癌患者临床特征关系 例(%)

表4 DK-β、Lgr5、mTOR、P70s6k不同阳性表达强度与患者生存分析

3 讨论

胃癌疾病发展过程中其胃黏膜的上皮角化细胞排列紧密，且细胞之间嵌合，通过桥粒建立细胞间的连接，而细胞的排列的间隙则是膜被颗粒的排出物进行填充，起到保护的作用，组织有害物质侵入；但是胃黏膜的生物学的独特性，在受到损伤后，发生溃疡，并逐渐发生癌变[8]。

胃黏膜的癌变是一个漫长的过程，是一步步发展,最终成为恶性肿瘤；在溃疡炎性反应的造成细胞分化增生等过程中，APC基因，RAS基因的监控机制会被打破，所以角化细胞分泌DK-β的指标就会增加[9]；本次研究中，在低表达中更显著，且发生淋巴转移的表达中明显高于未发生转移的，所以对于DK-β的检查中可以对胃癌患者早期的病变有了解，对早期的筛选诊断具有积极的意义；但是对预后生存评估并没有明显的提示性。

Lgr5 是Wnt 信号通路的靶基因，是最近研究中发现的干细胞标志物，对肿瘤的转移，分期等具有可以作为主要的观察指标，在多种恶性肿瘤中，如结肠癌、宫颈癌等的相关研究中有高表达[10]。相关临床研究中，对食管组织实施免疫组化而发现Lgr5 表达情况显示，Lgr5 表达越高患者生存率越低。

mTOR/P70s6k的信号传导具有调节机体细胞正常代谢以及机体生长过程中的重要信号通道，在多种肿瘤组织中都可以发现，具有非常重要的位置。mTOR蛋白的结构分子主要包括包含靠近N末端heat结构亚基，介导某些蛋白一蛋白之间的相互作用，证实FAT结构亚基能够稳定mTOR的蛋白活性[11]。同时在激活后的mTOR蛋白，对p70S6激酶(P70S6kinase,p70S6K)有磷酸化作用，对肌动蛋白的细胞迁移，细丝重构有推动作用。通过对其深入的研究发现在肿瘤的表达中具有的信号传导、表达不断认知，其高表达与低表达对肿瘤患者的生存预估具有较高的预测价值。

本研究结果显示胃癌组织DK-β、Lgr5、mTOR、P70s6k的相对表达指标明显高于癌旁组织及对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。3组组织中DK-β、Lgr5、mTOR/P70s6k的m-RNA相关性比较呈正相关性(P<0.05)。3组组织的Lgr5、mTOR/P70s6k的胃癌组织阳性率的表达，明显高于癌旁组织以及对照组；3组组织中的DK-β阳性率的表达，其中癌旁组织的阳性率较胃癌组织以及对照组比显著增高，差异有统计学意义。DK-β、Lgr5、mTOR、P70s6k的阳性表达与胃癌患者年龄、性别比较差异无统计学意义(P>0.05)。DK-β在胃癌患者肿瘤直径大小阳性率的表达差异无统计学意义(P>0.05)。Lgr5、mTOR/P70s6k在胃癌患者肿瘤直径大小阳性率的表达<5 cm为(60.41%，58.33%，56.52%)与直径≥5 cm阳性率(86.48%，75.68%，72.97%)比较差异有统计学意义(P<0.05)。DK-β、Lgr5、mTOR/P70s6k在TNM分期，组织学分级，淋巴转移情况比较差异有统计学意义(P<0.05)。说明DK-β、Lgr5和mTOR/P70s6k在胃癌中的表达中对患者的肿瘤TNM分期，组织学分级，淋巴转移情况有密切的关系。

综上所述，Lgr5和mTOR/P70s6k的高、低表达对患者的预后生存情况有一定的预测评估价值，DK-β则可以作为早期的筛查手段，对患者早期血清中的检测可以进行筛选；以上指标对胃癌患者的筛查、胃癌的进展以及预后诊断多方面具有重要的应用价值。