荆纯祥,耿雪,焦润艺,赵自明,潘华山,冯毅翀
(1.广州中医药大学,广东 广州 51000;2.广东省中医药工程技术研究院,广东 广州 510095;3.成都医学院,四川 成都 610500)
既往研究表明高强度超负荷的连续运动导致运动性疲劳,而疲劳如果不能及时消除,则会引起机体一系列的神经内分泌紊乱[1-2]。中药黄芪能益气固表,适用于内伤劳倦、气血亏虚,目前正广泛应用于运动性疲劳的防治中。本研究选用黄芪主要有效成分黄芪总皂苷对模型大鼠进行灌胃治疗,从血清生殖激素水平及其中枢调控的角度深入探讨黄芪总皂苷对运动性疲劳雄性大鼠的影响。
1.1 药品与试剂。黄芪总皂苷提取方法参考[3],由广东省中医药工程技术研究院提供。T、LH、FSH、GnRH、Glu 和GABA 试剂盒,均由南京建成生物工程研究所提供。
1.2 实验动物。36 只10 周龄雄性SPF 级SD 大鼠,体重(200 士20)g,由广东省医学实验动物中心提供,实验动物质量合格证号:SCXK(粤)2008-0002。饲养于广州中医药大学实验动物中心SPF 级实验室内,实验动物使用许可证号:SYXK(粤)2008-0085。常规分笼喂养,自由饮水进食,室内温度21℃-24℃,相对湿度40% -55%,空气流通,光照时间l2h。
1.3 仪器。ZH-PT 动物实验跑台,淮北正华生物仪器设备有限公司;3K30G 型SIGMA 超速冷冻离心机,SIGMA 公司;TDL-5-A 型低速离心机,上海金鹏分析仪器有限公司;Multiskan 352 型MS 酶标仪,芬兰LABSYSTEM 公司;JJ-1型组织匀浆机,深圳天南海北公司。
1.4 模型复制。动物适应性饲养2 天后,采用“坡度为0,速度为15m/min,跑台20min 后,间隙40min,再跑台20min,每天1 次,连续14 天”的中等运动强度跑台运动复制运动性疲劳模型大鼠。
1.5 分组与处理。36 只雄性SD 大鼠随机分为正常组、模型组和给药组(黄芪总皂苷)三组。给药组以50 mg/kg 黄芪总皂苷灌胃,正常组和模型组以等量生理盐水灌胃,每天1次。模型组和给药组大鼠在灌胃1h 后进行中等强度水平跑台训练,每天1 次,连续14 天,正常组常规饲养。在末次跑台运动后,戊巴比妥纳(45 mg/kg)腹腔麻醉后,处死大鼠,断头取血2 mL,2000 rpm 离心5 min,分离血清置于-40°C冰箱贮存,用于血清T、LH、FSH 和GnRH 含量检测。沿枕骨大孔与大鼠耳缘上连线处剪开颅腔,取完整全脑,用4℃生理盐水清洗,滤纸吸干,置于冰盘内,参照大鼠脑立体定位图谱,在冰面上迅速分离下丘脑,加0.1 mol/L 高氯酸,冰浴下制备脑组织匀浆,4℃,14000 g 离心20 min,取上清液,0.2μm 滤膜滤过,分装,-80℃冷藏[4],用于下丘脑GnRH、Glu 和GABA 含量检测。
1.6 指标检测。采用放免法(RIA)检测血清T、LH、FSH和GnRH 含量,严格按照试剂盒操作指示操作。采用酶联免疫吸附(ELISA)检测下丘脑GnRH、Glu 和GABA 含量,严格按照试剂盒操作指示操作,最后在酶标仪450 nm 处测得OD 值。
2.1 黄芪总皂苷对运动性疲劳雄性大鼠血清T、LH 和FSH含量的影响。由表1 可知,与正常组比较,模型组大鼠血清T 含量显著降低(P<0.01)、FSH 含量显著升高(P<0.01);与模型组比较,给药组大鼠血清T 和LH 含量显著升高(均有P<0.01)、FSH 含量显著降低(P<0.01),见表1。
表1 对运动性疲劳雄性大鼠血清T、LH 和FSH 含量的影响
表1 对运动性疲劳雄性大鼠血清T、LH 和FSH 含量的影响
注:与正常组相比,*P<0.05,**P<0.01;与模型组相比,#P<0.05,##P<0.01。
分组 T (nmol/L) LH (IU/L) FSH(IU/L)正常组 2.42±1.20 3.53±0.45 4.09±0.53模型组 1.18±0.57** 3.68±0.40 5.14±0.48**给药组 2.03±0.71## 4.13±0.38## 3.92±0.48##
2.2 黄芪总皂苷对运动性疲劳雄性大鼠GnRH 含量的影响。由表2 可知,与正常组比较,模型组大鼠血清GnRH 含量显著升高(P<0.01)、下丘脑GnRH 含量显著降低(P<0.01);与模型组比较,给药组大鼠血清GnRH 含量显著降低(P<0.01)、下丘脑GnRH 含量显著升高(P<0.01)。
表2 对运动性疲劳雄性大鼠GnRH 含量的影响
表2 对运动性疲劳雄性大鼠GnRH 含量的影响
注:与正常组相比,*P<0.05,**P<0.01;与模型组相比,#P<0.05,##P<0.01。
分组 血清GnRH(pmol/L) 下丘脑GnRH(ng/ml)正常组 4.11±0.92 12.78±0.95模型组 5.93±0.89** 9.16±0.70**给药组 4.42±0.85## 11.83±0.59##
2.3 黄芪总皂苷对运动性疲劳雄性大鼠下丘脑Glu 和GABA含量的影响。由表3 可知,与正常组比较,模型组大鼠Glu含量显著降低(P<0.01)、GABA 含量显著升高(P<0.01);与模型组比较,给药组大鼠Glu 含量显著升高(P<0.01)、GABA 含量显著显著降低(P<0.01)。
表3 对运动性疲劳雄性大鼠下丘脑Glu 和GABA 含量的影响
表3 对运动性疲劳雄性大鼠下丘脑Glu 和GABA 含量的影响
注:与正常组相比,*P<0.05,**P<0.01;与模型组相比,#P<0.05,##P<0.01。
分组 Glu(ng/ml) GABA(ng/ml)正常组 22.26±0.85 13.67±0.85模型组 15.47±0.71** 20.46±1.54**给药组 23.43±1.83## 15.32±1.24##
现代研究表明,持续超负荷运动导致疲劳,而疲劳若不能及时恢复将导致生殖激素水平紊乱,其可能机制是持续超负荷运动中能量物质的大量消耗影响HPG 轴(下丘脑-垂体-性腺轴)功能:① 在疲劳、过度训练状态时,血清生殖激素水平发生改变,T 水平会下降,而LH 和FSH 变化不明显或无反馈性上升,运动时骨骼肌对T 消耗增加以及HPG轴功能在多环节被抑制导致T 水平的明显下降,而LH 和FSH 无反馈作用则是HPG 抑制GnRH 释放;②GnRH 是下丘脑分泌的调控生殖系统功能的信号分子,运动性疲劳状态下下丘脑抑制GnRH 的释放,但新近研究表明消化道也能产生GnRH,所以外周GnRH 水平不能完全反映下丘脑GnRH的释放水平;③兴奋性氨基酸Glu 对神经元具有兴奋性调节作用,运动过程中Glu 在谷氨酸脱羧酶催化下生成GABA,GABA 具有抑制触突传导作用,GABA 含量升高是运动性疲劳出现中枢保护性抑制的重要因素。本研究通过每天进行1次中等强度的水平跑台运动复制出运动性疲劳大鼠模型,检测发现模型大鼠血清T 含量、下丘脑GnRH 和Glu 含量显著降低,血清FSH、GnRH 和下丘脑GABA 含量显著升高,提示运动性疲劳状态下存在HPG 轴功能抑制,外周生殖激素水平紊乱的情况。
在中医典籍中虽然无“运动性疲劳”的明确论述,但与形体过用产生的疲劳及其相关病因病理的记载颇多,中医认为运动性疲劳属于内伤病范畴,是由于过度超负荷运动而产生的内生“邪气”,与机体抗疲劳的自稳机制相互作用,结果正气受损导致脏腑经络功能异常,气血紊乱,阴阳失调,导致机体对环境和运动训练的适应性降低,运动能力明显下降。中药黄芪具有补气升阳、利水消肿、生津养血、托毒生肌等功效,现代研究表明黄芪及其有效成分具有抗衰老、抗菌、抗病毒、抗癌,调节机体免疫,调节血糖、改善血液流变学、保护泌尿系统、也血管系统等药理作用。本研究选择黄芪有效成分黄芪总皂苷对运动性疲劳雄性大鼠进行灌胃,灌胃量为50 mL/kg,给药大鼠血清T 和LH 含量、下丘脑GnRH和Glu 含量显著升高,血清FSH、GnRH 和下丘脑GABA含量显著降低。研究提示,黄芪总皂苷通过纠正中枢Glu 和GABA 代谢失衡的情况,改善HPG 轴抑制状态,从而调节运动性疲劳状态下外周生殖激素水平紊乱的情况,对机体生殖系统起到保护作用。