利用SSR标记对水稻7组衍生品种的遗传多样性分析

马 菊, 赵锦祥, 林郑希, 谢永波, 陈志伟, 毛大梅, 周 彬, 官华忠

(福建农林大学作物遗传育种与综合利用教育部重点实验室/福建省作物设计育种重点实验室，福建 福州 350002)

水稻是我国的重要主粮[1-2]，随着育种方法的创新和品种审定制度的改革，越来越多的水稻品种通过审定，得以推广.但“审定品种多，突破性品种少”依然是当前育种的难关[3].同时，在品种审定推广后，也常发现推广品种的DNA指纹与审定时的标准样品DNA指纹存在差异，造成有可能被判定为销售假种子的风险.两者DNA指纹差异的原因之一是参试时亲本代数偏低使得其衍生后代DNA指纹存在差异.如王慧等[4]利用NY/T 1433—2014推荐的SSR标记(48对)分析了不同世代恢复系的纯合位点，结果表明，在F8代供试恢复系还有1～2个位点未纯合.因此，鉴别衍生品种的遗传差异，将有助于指导亲本的育种利用和推广.传统的形态鉴定已经不能满足品种更新换代快的要求[5].有必要采取能直接反映品种DNA水平差异的分子手段，如以 PCR为基础的SSR标记，其具有多态性高、重复性好、可靠性高和DNA用量少等特点，已在遗传图谱构建、基因定位、遗传多样性分析和品种真实性鉴定等方面得到了广泛应用[6-10].如从夕汉等[11]通过SSR标记分析了来自东南亚的62个籼稻品种的遗传多样性，结果表明，这些品种的亲缘关系较近.其另一项对56个杂交稻亲本的遗传多样性分析也表明，亲本间的遗传相似系数为0.63～0.98，说明这些亲本的遗传多样性较差[12].罗兵等[13]通过SSR标记分析了太湖稻区常规粳稻的遗传多样性，发现少数亲本的重复使用造成该地区选育品种亲缘关系近，品种的品质和产量难以进一步提高.陈羽红等[14]利用SSR标记构建了12份黑龙江省建三江地区主栽粳稻品种的指纹图谱，为这些品种的鉴定和品种保护提供依据.林亦霞等[15]利用NY/T 1433—2014推荐的48对SSR引物建立94份杂交稻亲本DNA分子数字指纹库，结果表明，该组引物在水稻指纹鉴定中具有较高的准确性.但SSR标记对水稻衍生品种的遗传多样性研究还较少.

本研究以NY/T 1433—2007(24对)[16]和NY/T 1433—2014(48对)[17]公布的53对SSR标记对7组衍生品种及其亲本进行遗传多样性分析，并比较两组标准引物的鉴定效率.

1 材料与方法

1.1 材料

本试验的7组衍生品种分别为(表1)：来自华占杂交后代的金恢26和金恢27；来自福恢673回交后代的福恢683；来自福恢676回交后代的金恢35和金恢36；来自南恢175回交后代的福恢639；来自金泰B回交后代的福153B、福157B和福199B；来自RGD-7s//Y58s/CMA176杂交F4的姐妹系福华s、福正s；来自RGD-7s//Y58s/M215B杂交F4的姐妹系福茂9s和福茂8s.

表1 7组衍生品种和来源1)Table 1 Seven groups of rice-derived varieties and the origins

1)CMA-176与M215B为姐妹系.

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取 在3叶期，每个品种剪取1.5 mL离心管等长叶片置于已加钢珠的离心管中，加150 μL SDS提取液，用高通量组织研磨仪震碎，随后采用SDS小量法[18]提取供试品种的DNA.

1.2.2 PCR扩增及扩增产物检测 采用NY/T 1433—2007(24对)和NY/T 1433—2014(48对，其中19对与NY/T 1433—2007一致)公布的53对SSR引物进行遗传多样性分析.

PCR反应体系为15 μL体系[2xPCR MIX(惠凌生物)4.0 μL，上下游引物各0.75 μL，7.5 μL纯净水，2 μL DNA模板(20 ng·μL-1)].

PCR的反应程序：先进行预变性(94 ℃)5 min；然后温度变化依次为94 ℃、55 ℃、72 ℃的循环33次，每个温度持续30 s；最后再延伸10 min(72 ℃)；结束程序并于4 ℃保存.

PCR产物在6.0%非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳90～100 min，使有多态的条带分离，再用银染法显色.显色后的胶置于医用X光玻璃上观察扩增结果.

1.2.3 数据分析 每对引物扩增的主带(即扩增效率最高的片段)进行读带，相同片段位点按有带记为“1”，没带记为“0”.用PopGene 32软件计算各SSR引物的等位基因位点数(Na)、有效等位基因位点数(Ne)和Shannon信息指数(I)，并计算多态性信息含量(PIC)[19].通过NTSYS 2.10e软件对所得数据计算遗传相似系数，并以该结果进行聚类分析.

2 结果与分析

2.1 SSR标记的多态性

53对SSR引物在21份水稻品种的PCR扩增结果表明，有47对引物具有多态性，占88.68%；剩下的6对引物(RM176、RM423、RM551、RM567、RM339和RM471)在这些品种中没有多态.47对有多态的引物共检测到135个等位位点，每个标记平均有2.872 0个等位位点，变幅为2～5；其中RM336和RM481检测到的等位位点最多，为5个.有效等位基因数平均值为2.14，变幅为1.272 7～4.741 9，前两位依旧是RM336和RM481.Shannon信息指数的均值为0.811 4，变幅为0.410 1～1.583 5，最高为RM336，其次是RM481.多态性信息含量(PIC)平均值为0.482 1，变幅为0.214 2～0.789 1，其中14对引物具有高的PIC值(>0.6)，前3名分别是RM336(0.789 1)、RM481(0.757 4)和RM71(0.730 2)(表2).另外，RM481在供试恢复系衍生品种中表现出较高的多态性，能将同一来源的衍生品种(如金恢26和金恢27、福恢673和福恢683；金恢35和金恢36、南恢175和福恢639)区分开来(图1).综上所述，筛选作为国标DNA指纹鉴定的SSR标记具有较高的多态性，其中RM336和RM481在本次试验中检测的等位基因位点数、有效等位基因位点数、Shannon信息指数和多态性信息量最高，表明其扩增位点多态性较丰富.

表2 SSR引物在21个水稻品种间的多态性分析Table 2 Polymorphism analysis of SSR primers among 21 rice cultivars

2.2 聚类分析

利用NTSYS软件计算出品种间的遗传相似系数，其平均值为0.552 6，变化范围为0.304 8～1.000 0.其中，Y58s与M215B的遗传相似系数最小(为0.304 8)；而来自金泰B为轮回亲本的BC3F4代衍生姐妹系福153B和福157B在所检测标记中无多态性，遗传相似系数达1.000 0，应为同一品种.

按UPMGA方法进行聚类(图2).结果显示，遗传相似系数0.55时，可以将供试材料分为5个类群，分别为Y58s与其他材料遗传相似系数小，被单独分为一类；华占及其衍生品种(金恢26、金恢27)为1个类群；来自福建省农科院水稻所的恢复系为1个类群；来自福建农林大学的保持系为1个类群；除Y58s的其他两系不育系分为1个类群.再进一步分类可明显将供试的7组衍生品种分出来，如福茂8s和福茂9s，福正s和福华s，福153B、福157B、福199B和金泰B，金恢35、金恢36和福恢676，福恢673和福恢683，南恢175和福恢639.说明53对SSR引物对水稻衍生品种的遗传多样性鉴定具有较高的准确性，能将7组供试衍生品种分类.

2.3 24对引物和48对引物的鉴定效率

比较衍生品种与相应亲本及同组衍生品种之间的遗传相似系数在24对引物(NY/T 1433—2007)、48对引物(NY/T 1433—2014)和这2组引物总和的差异，分析这3组标记对各衍生品种的鉴定效率(图3).结果表明，通过杂交育种获得华占衍生后代中，金恢26/金恢27、金恢26/华占和金恢27/华占在24对引物的遗传相似系数分别为85.11%、79.17%和77.55%，相比高于48对引物的遗传相似系数(72.34%、71.58%和71.58%)和总引物的遗传相似系数(72.38%、69.81%和71.03%)；而杂交育种的高代衍生系(F4代以后)中，福华s/福正s在24对引物的遗传相似系数(83.33%)低于48对引物和总引物的遗传相似系数(分别为89.13%和88.46%).而源自回交育种的衍生系其24对引物的遗传相似系数普遍低于48对引物和总引物的遗传相似系数，如福恢683/福恢673(75.00%<79.57%<80.00%).说明标记数的增加能提高衍生品种遗传相似性的鉴定效率.

3 小结与讨论

目前，SSR标记用于水稻遗传多样性的分析已有较多报道，发现SSR标记具有较高的多态信息量.如林强等[20]利用94对SSR标记在24个品种中检测出272个等位位点，多态性信息量(PIC)平均值为0.680 0.徐福荣等[21]利用48对引物在云南省水稻主要育成品种(系)中共检测到214个等位位点，每个标记平均为4.458 0个，多态性信息含量(PIC)平均值为0.605 8.本研究中，47对有多态的引物共检测到135个等位位点，每个标记平均有2.872 0个等位位点，变幅为2～5，多态性信息含量(PIC)平均值为0.482 1.本研究SSR标记的PIC值以及检测位点数均低于林强等[20]和徐福荣等[21]的研究结果，这可能是供试水稻品种来源较单一所造成的.

另外，SSR标记对水稻遗传多样性研究(特别是相似品种)的准确性也要高于其他类型的分子标记，如RAPD、同工酶和形态标记[22,23].余汉勇等[23]比较SSR标记、等位酶和形态标记对矮仔占衍生品种遗传差异的鉴定效率，研究表明，SSR标记对遗传相似品种的鉴别效果最好，能将衍生品种的遗传差异区分开来.韩迎春等[24]利用SSR标记也能有效区分10个遗传基础相近的旱稻品种.本研究基于47对SSR引物PCR结果的聚类分析能准确地将7组来源不同的衍生品种分类出来.该结果进一步证实SSR标记在衍生品种的遗传多样性分析中具有较高的准确性.

育种家更关心需要多少标记才能在实践中区分衍生品种.肖小余等[25]研究表明，单一标记进行品种鉴定的准确率低；标记数量增加则有利于区分品种的遗传差异，但会导致成本增加、工作效率下降.戴冬青等[26]研究表明，等位基因多且多样性指数高的SSR标记对长江流域主推早籼品种的鉴别力较强.本研究比较了24对引物、48对引物和53对引物对7组衍生品种的鉴定效率，研究表明，标记数的增加能提高对衍生品种遗传相似性的鉴定效率.如增加标记能更大程度上将遗传差异较大的衍生品种的差异位点检测出来；反之，若衍生品系较相似(如回交后代和杂交育种高世代衍生品种)，增加标记则检测出更多相似位点，从而使遗传相似系数上升.而鉴定衍生品种需要的标记数量，还需要进一步试验.依据前人研究结果，建议优先使用多态性高的SSR标记，如本研究发现的RM336和RM481；若还无法鉴定，则逐渐增加标记数量(PIC值高的标记优先).