茶树CsPAL3基因的启动子克隆及表达分析

唐秀华, 孙威江, 陈志丹, 谢 凤, 陈佳佳

(1.福建农林大学园艺学院，福建 福州 350002;2.福建茶叶进出口有限责任公司，福建 福州 350014; 3.福建农林大学安溪茶学院，福建 泉州 362400;4.福建省茶产业工程技术研究中心，福建 福州 350002)

植物叶片呈色受光照影响较为明显，研究表明，花青素是植物叶片呈色的关键色素，其生物合成和代谢均受光照调节.茶树(Camelliasinensis)花青素生物合成相关结构基因中的PAL基因由多基因家族编码，目前NCBI上已登录的有PALa-f、PAL3等一系列家族成员，其基因表达受自身发育和环境因素调控[1].启动子是基因5′端与RNA酶及一些反式作用因子结合的区域，指的是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列.启动子的顺式作用元件与细胞内的蛋白信号(反式作用因子)或者环境中的光照、温度等因素相互作用，定时、定位及定量地表达所需的基因产物.因此，研究启动子可进一步探讨植物对生长环境的适应机制以及更好地控制外源基因在转基因植物中的表达[2].早期，学者研究强光照显著促进了不同植物PAL酶活性，并加速花青素合成[3-11].光照环境通过光敏色素影响PAL活性，从而调控PAL基因表达.但茶树的PAL基因还未见相关报道，本研究克隆茶树CsPAL3基因的启动子序列，对该序列进行生物信息学分析，并采用锡箔纸遮阴的处理方式，检测茶树CsPALs基因家族成员的表达模式，为进一步研究CsPAL3启动子功能性奠定基础.

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料为紫化茶树武夷奇种C18，由武夷星茶业有限公司种质资源圃提供.选取生长发育良好，长势一致的茶树，每株茶树一半数量的第2叶位叶片采用锡箔纸进行遮阴，作为遮阴组；另一半为自然条件下光照，作为光照组.经过2、4、6、8和10 d的处理，分别采摘遮阴组和光照组的茶树叶片样品，用液氮速冻，存放于-80 ℃冰箱，用于后续试验.

试剂：Biospin Plant Genomic DNA Extraction Kit(BioFlux公司)、Tks GflexTMDNA Polymerase(TaKaRa公司)、Genome Walking Kit(TaKaRa公司)、pMD19-T Vector Cloning Kit(TaKaRa公司)、大肠杆菌JM109感受态细胞(TaKaRa公司)、SYBR®Premix Ex TaqTM Ⅱ(Tli RNaseH Plus) Kit(TaKaRa)、Plant RNA Kit(OMEGA公司)、RNase-Free DNase Ⅰ Set(OMEGA公司)、GoScriptTMReverse Transcription System(Promega公司)等，引物合成及菌液测序由北京六合华大基因科技有限公司完成.

1.2 方法

1.2.1 茶树基因组DNA提取 根据Biospin Plant Genomic DNA Extraction Kit试剂盒说明书提取紫化茶树武夷奇种C18的基因组DNA.

1.2.2CsPAL3基因的启动子克隆 在进行PCR试验之前需用DNA样品对已知序列进行验证，已确认该序列正确性.根据NCBI上已登录的茶树CsPAL3基因(登录号为KY865305.1)序列，选取扩增片段(不少于500 bp)，设计特异性引物即外侧引物YZ-F1、YZ-R1和内侧引物YZ-F2、YZ-R2(表1)，采用25 μL的加样体系，进行巢式PCR扩增.第1次PCR混合液组成：0.5 μL的模板DNA、12.5 μL的2×Gflex PCR Buffer、0.5 μL的Tks Gflex DNA Polymerase、各0.5 μL的外侧引物(10 μmol·L-1)，加ddH2O补足25 μL.扩增反应条件：94 ℃预变性1 min，98 ℃变性10 s，55 ℃退火温度15 s，68 ℃延伸30 s，共25个循环，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃永久保存.取第1次PCR产物5 μL，浓度1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测.参数：120 V，30 min，电泳结束后于凝胶成分分析系统下观察结果并拍照，以DL2000 Marker作为分子质量标准.第2次PCR混合液组成：0.5 μL的第1次PCR产物为模板、12.5 μL的2×Gflex PCR Buffer、0.5 μL的Tks Gflex DNA Polymerase、各0.5 μL的内侧引物(10 μmol·L-1)，加ddH2O补足25 μL.其扩增反应条件同第1次PCR扩增反应条件.取第2次PCR产物5 μL，琼脂糖凝胶电泳检测方法亦同第1次PCR扩增.获得特异性目的条带，切胶回收，将PCR产物直接送去测序.测序结果采用在线软件Sequencher 4.2与已知序列进行比对分析，判断其正确性.

参照Genome Walking Kit试剂盒说明书的启动子引物设计原则，分别设计3条退火温度较高的特异性下游引物SP1、SP2和SP3，以染色体步移法试剂盒中自带的4种退火温度较低的兼并引物AP1、AP2、AP3和AP4为上游引物，分别进行3轮热不对称PCR扩增反应[12].选取特异性目的条带，切胶回收，连接至载体pMD19-T，转化至大肠杆菌JM109感受态细胞，于37 ℃培养箱中过夜培养.进行菌落PCR鉴定，挑选6个阳性克隆菌株于LB液体培养基中，在200 r·min-1、37 ℃下摇菌6 h，将菌液送测.

1.2.3 CsPAL3基因的启动子序列分析 获得茶树CsPAL3基因的启动子序列，在植物顺式作用调控元件(PlantCARE)数据库(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)上预测分析该序列所包含的顺式作用元件.通过Blast，与已发表的茶树基因组(http://www.plantkingdomgdb.com/tea_tree/data/assembly/)进行差异比对，寻找启动子序列相似序列，再提取对应序列，用mafft对茶树CsPAL3基因的启动子序列和参考基因组对应序列做多序列比对，统计差异信息.

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.4 不同遮阴时间下的CsPALs基因家族成员的表达分析 选取3株生长发育良好，长势一致的紫化茶树武夷奇种C18，以第2叶位紫色叶片为试验材料，每株茶树的一半为自然光照，另一半为锡箔纸遮阴.以2017年9月30日采摘为对照组CK，每2 d分别取1次光照组和遮阴组的茶样，经过2、4、6、8、10 d的光照和遮阴处理.用液氮速冻，存于-80 ℃冰箱，用于后续的RNA提取、cDNA合成和RT-qPCR，以GAPDH为内参引物[14]，参照唐秀华等[15]方法，设计引物(表2)，并进行qPCR试验.

表2 引物序列Table 2 Primer sequences

2 结果与分析

2.1 茶树基因组DNA检测结果

根据植物DNA提取的试剂盒说明书提取紫化茶树武夷奇种C18基因组DNA，如图1所示，该DNA条带清晰完整，通过检测其核酸质量，浓度为773.9 ng·μL-1，D260 nm/D280 nm为1.89，D260 nm/D230 nm为2.11.该DNA样品满足条件，可用于后续试验.

2.2 CsPAL3基因的启动子克隆

以上述DNA样品为模板，采用验证引物YZ-F1、YZ-R1、YZ-F2和YZ-R2进行巢式PCR扩增，以YZ-F2引物对第2次PCR产物进行测序，测序结果表明与已知序列具有相关性.根据染色体步移法的试剂盒说明书，用自带的简并引物AP1、AP2、AP3和AP4分别与设计的特异性引物SP1、SP2、SP3进行热不对称PCR扩增，引物AP4与CsPAL3的特异引物SP2的PCR产物出现单一条带，特异性较强，片段约800 bp(图2).通过克隆测序，结果表明(图3)，该5′端侧翼序列根据已知序列得到，CsPAL3基因启动子序列为501 bp.

2.3 茶树CsPAL3基因的启动子序列分析

通过PlantCARE在线软件分析(表3)，CsPAL3基因启动子区除了含有CAAT-box和TATA-box核心启动子元件之外，还有多种与植物逆境相关的顺式作用元件，其中光响应元件较多，包含G-box、GA-motif、I-box、Sp1等，结果表明该基因明显受光照调控，并且与茶树对生长环境的适应机制具有相关性.通过与茶树基因组对应的序列比对，结果表明，SNP数量为15个，插入缺失数量为5个，插入缺失片段为29 bp，移码突变数量为4个.

2.4 不同遮阴时间下的茶树CsPALs基因家族成员的表达分析

采用qPCR技术，检测武夷奇种C18的CsPALs基因家族成员在不同遮阴时间处理下的表达情况(图4).时间和遮阴处理对茶树CsPALs基因家族成员的相对表达量均存在显著性差异，随着处理时间的增加，CsPALs基因家族成员的表达量在光照组和遮阴组均呈现下降趋势，其中仅CsPALf基因表达量下降幅度不明显.并且，CsPALs基因家族成员在遮阴组的表达量较光照组下降程度更明显，表明遮阴处理使得CsPALs基因家族成员的表达量显著下调，可见CsPALs基因家族成员均受光照调控.其中CsPALa、CsPALb、CsPALc和CsPALf在遮阴处理4 d的相对表达量降低最明显，CsPALd和CsPAL3均在遮阴处理2 d的相对表达量降低最明显.

3 讨论

启动子是位于基因起始位点的上游序列，具有转录起始的特异性，活化RNA酶，位于结构基因上.转录因子(又称“反式作用因子”)在基因表达调控中能直接或间接地识别或结合在启动子的各顺式作用元件序列上，参与调控靶基因转录.目前在牵牛花[16]、绿竹[17]、水稻[18-19]、麻疯树[20]、玉米[21]等植物中相继克隆PAL基因启动子，研究表明，水稻OsPAL和麻疯树JcPAL基因启动子均存在保守元件TATTTAA，其中麻疯树JcPAL基因启动子还存在光响应、赤霉素、脱落酸、细胞分裂素、激发子、干旱、冷害等大量胁迫应答元件.玉米ZmPAL基因表达量受到茉莉酸甲酯(MeJA)诱导，推测其启动子序列上可能含有响应生物胁迫的应答元件，进而参与玉米的逆境胁迫应答.本研究首次在紫化茶树上克隆得到CsPAL3基因启动子序列501 bp，该序列中除了高等植物具备的核心启动子区即TATA区和CAAT区之外，也存在与水稻、麻疯树相同的保守元件TATTTAA，还具有大量的光响应元件、脱落酸等各类激素应答元件、干旱等胁迫响应元件等植物生长发育相关的顺式作用元件，可见CsPAL3基因启动子转录活性可能受到光照、激素信号及逆境胁迫等环境因素的调控.

表3 CsPAL3基因启动子区与逆境响应相关的主要顺式作用元件预测Table 3 Prediction of major stress-related cis-elements in CsPAL3 promoter

光照对植物生长发挥重要作用，主要包括间接作用和直接作用.间接作用是通过光合作用制造有机物为植物生长发育提供物质和能量基础；直接作用是光控制植物形态建成[22].遮阴影响着植物的光合特性，当遮阴度达到50%时，中华金叶榆的叶片由彩叶完全转变为绿叶，体内PAL酶活性与光胁迫梯度之间存在显著的负相关关系[23].彭东[24]研究表明遮阴可以抑制烟叶PAL酶活性，朱灿灿[25]在轻度遮阴处理条件下，发现银杏GbPAL基因表达呈现波动下降的变化趋势.包玉[26]等研究表明遮阴使得金叶女贞叶色由金黄色变为暗绿色，使得红花檵木红色变浅.金琦芳[27]等对紫化茶树武夷奇种C18遮阴进行不同程度的遮阴，发现叶片由紫色转向黄绿色略紫，并且光照越强，叶片颜色越紫.唐秀华[28]等在转CsPAL3基因拟南芥植株中，初步证实了CsPAL3基因是受光照环境调控的.本研究表明，随着处理时间增加，CsPALs基因家族成员的相对表达量在遮阴组和光照组中均呈现降低趋势，其中遮阴组较光照组降低程度更显著.CsPALa在遮阴处理4 d后的表达量降低最明显，CsPALb在遮阴处理4 d后的表达量降低最明显，CsPALc在遮阴处理4 d后的表达量降低最明显，CsPALd在遮阴处理2 d后的表达量降低最明显，CsPAL3在遮阴处理2 d后的表达量降低最明显，CsPALf在遮阴处理4 d后的表达量降低最明显.可见，遮阴处理使CsPALs基因家族成员的相对表达量呈现下调趋势，因此，推测CsPALs基因家族成员均受光照调控.