桃李细菌性穿孔病新病原的分离鉴定

童亚萍, 杨丙烨, 田 茜, 胡方平, 蔡学清

(1.福建农林大学植物保护学院，福建 福州 350002；2.中国检验检疫科学研究院，北京 100176)

桃李细菌性穿孔病是核果类作物的主要病害之一，据报道，引起该病的病原菌仅为树生黄单胞菌桃李致病变种(Xanthomonasarboricolapv.pruni)[1].

2015年至今，福建省古田县的桃和李种植区细菌性穿孔病发生严重.作者对田间采集的发病叶片、果实和茎杆进行病原分离时，发现有65%以上的病斑均可分离到两类不同形态特征的细菌菌落：一类菌落呈淡黄色、圆形隆起且黏稠；另一类菌落黄色、圆形扁平，不黏稠.烟草过敏性和致病性测定结果显示，淡黄色黏稠的菌落有过敏反应且致病性强，而黄色、扁平的菌落无过敏反应但能致病，致病性较弱.经鉴定，前者为已报道的桃李细菌性穿孔病的病原菌——树生黄单胞菌桃李致病变种，而后者疑似为成团泛菌(Pantoeaagglomerans).Burr et al[2]研究表明,成团泛菌能在石竹花和甜菜上引起菌瘿；Tho et al[3]发现该菌能引起洋葱叶枯萎病和鳞茎腐烂病，并且在某些地区发病率达80%以上；Guadalupe et al[4]发现成团泛菌能使玉米和高粱的叶片和维管束枯萎；洪永聪等[5]和谢关林等[6]研究表明，成团泛菌能影响稻谷的灌浆与发育；Medrano et al[7]和刘雅琴等[8]发现成团泛菌可以侵染不同品种的棉花,造成烂铃病；Yang et al[9]研究表明,成团泛菌是引起核桃褐色顶端坏死病的主要病原菌之一.但目前尚未见成团泛菌引起桃李细菌性穿孔病的报道.本试验就分离得到的细菌对桃和李的致病性及其分类地位进行研究，为深入了解该病害的发生发展规律提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 材料

表1 供试菌株Table 1 Strains tested in this study

1.1.1 供试菌株 供试的30株细菌菌株是从福建省古田县采集的白凤桃、芙蓉李病叶、病果和病茎杆上分离、纯化获得(表1).对照菌株H11(P.agglomerans)由吉林农业大学高洁教授惠赠，Li20(X.arboricolapv.pruni)从福建省古田县芙蓉李病果上分离并保存.

1.1.2 供试植物 白凤桃和芙蓉李苗购自福建古田县科委名优水果场，种植在温室盆钵中，备用.

1.2 方法

1.2.1 细菌的分离与纯化 采用平板划线分离法[10]对细菌进行分离纯化.

1.2.2 烟草过敏性反应测定 参照方中达[10]的方法，将细菌悬浮液(D600 nm=0.8)注射在烟草叶片的细胞间，观察注射点周围是否出现过敏性枯斑.

1.2.3 致病性测定 采用喷雾接种的方法，菌液接种浓度为D600 nm=0.8，每个供试菌株喷雾接种3个枝条，每个枝条叶片数平均约为20片，以每片叶的正反面均喷湿为准，套袋保湿24 h，第2天开始观察并记录发病情况.以喷雾接种黄单胞菌Li20菌株、Li20和Ly8混合菌悬浮液为阳性对照，以接种无菌水为阴性对照.对接种后发病的病斑再进行病原菌的分离与纯化.

1.2.4 革兰氏染色 采用结晶紫草酸铵染色法进行测定.

1.2.5 电镜测定 采用磷钨酸负染法进行染色并在透射电子显微镜(Hitachi HT7700)下观察.

1.2.6 生理生化特性测定 运动性、好氧与厌氧性，海藻糖、甘露醇、山梨醇、阿拉伯糖、丙三醇、葡萄糖、丙二酸盐和柠檬酸盐的利用，以及蔗糖还原、七叶灵水解、硝酸还原、硫化氢(H2S)的产生、吲哚的产生、明胶水解、淀粉水解参照方中达[10]的方法；在YDC培养基上色素的产生参照Schaad et al[11]的方法；苯丙氨酸脱氨酶的产生参照洪永聪[12]的方法.以H11为对照菌株.

1.2.7 Biolog测定 采用Gen Ⅲ Microstation biolog自动微生物鉴定系统进行鉴定.

1.2.8 分子生物学鉴定 16S rDNA基因鉴定参照Moreno et al[13]的方法；fusA、gyrB、leuS、pyrG、rpoB、rlpB等6个看家基因的多位点序列分析(multi-locus sequence analysis, MLSA)参照Deletoile et al[14]的方法.用贝叶斯法构建16S rDNA系统发育树，MLSA采用最大似然法.

2 结果与分析

2.1 病害的田间症状

桃树叶片上呈现圆形或不规则形的紫褐色或黑褐色病斑，周围有明显黄色晕圈(图1A)，而李树的叶片上病斑多数发生在叶脉附近(图2A、2B)，病斑后期脱落会形成穿孔.果实上呈现黑色或黑褐色圆形病斑，后期凹陷，桃果实上的病斑易干裂(图1B)，而李果实上的病斑周围水渍状明显，无开裂(图2C).另外，李树茎杆上会形成褐色条状坏死斑，严重时树皮开裂(图2D).

2.2 菌落形态

供试菌株在NA平板上培养1～2 d的菌落呈黄色、圆形，透亮润泽；培养3～5 d后，菌落变扁平，且周围开始分泌白色易流动物质(图3A).在KB平板上生长的菌落呈明黄色(图3B).

2.3 烟草过敏性反应和致病性测定结果

30株供试菌株均无烟草过敏性坏死反应.2015—2019年，桃和李单独接种供试菌株后所表现的症状(图4A、4E-F)均与田间发生的症状、单独接种树生黄单胞菌后所表现的症状(图4B、4G)以及混合接种供试菌株和树生黄单胞菌后所表现的症状(图4C、4H)相同.桃和李叶片喷雾接种供试菌株2～3 d后均出现圆形或不规则形的褪绿色水渍状病斑，随后病斑变红褐色或褐色，周围有明显黄色晕圈，病斑多出现在桃叶的叶缘和叶中(图4A)以及李叶的叶缘和叶脉上(图4E-F)，发病后期均造成叶片的穿孔和脱落.从接种后发病的病斑上又重新分离获得了菌落形态特征相同的菌株，经柯赫氏法则验证，这30株菌株均可对桃和李致病.

2.4 细菌鉴定

2.4.1 细菌的形态特征 供试菌株的菌体呈短杆状，大小为(1.8～2.7) μm×(0.9～1.3) μm，两端钝圆；革兰氏染色呈阴性，周生2～4根鞭毛(图5).

2.4.2 生理生化特性 供试菌株在YDC培养基上不产生褐色素，兼性厌氧，可利用葡萄糖产酸但不产气，具运动性，可利用阿拉伯糖、丙三醇、甘露醇、海藻糖和山梨醇；七叶灵水解、柠檬酸盐和丙二酸盐的利用、吲哚的产生、H2S的产生和明胶液化测定结果为阳性，蔗糖还原、淀粉水解及卵磷脂酶、苯丙氨酸脱氨酶和硝酸还原测定结果为阴性.与对照菌株H11的测定结果一致.供试菌株被初步鉴定为P.agglomerans.

2.4.3 Biolog测定 从2.4.2可知，30株菌株的19项生理生化指标的测试结果均一致，因此，随机挑选6株菌株进行71种碳源利用及23种化学敏感性测试.培育48 h后经Microlog软件读数，结果显示6株菌株均与数据库中P.agglomerans的相似度最高(表2).

2.4.4 16S rDNA基因鉴定结果 利用16S rDNA基因的通用引物27F/1492R对4株供试菌株进行PCR扩增后测序，将测序结果在NCBI上在线比对显示，供试菌株与P.agglomerans的16S rDNA基因序列的相似性达99%.

Mrbayes上采用GTR+G+I模型，以大肠杆菌(EscherichiacoliT)为外群，并下载成团泛菌(P.agglomeransT)、菠萝泛菌(P.ananatisT)、分散泛菌(P.dispersaT)、斯氏泛菌(P.stewartiiT)、柠檬泛菌(P.citreaT)、斑点泛菌(P.punctataT)、瓦氏泛菌(P.vagansT)(=P.agglomerans)、土壤塔特姆菌(TatumellaterreaT)(=土壤泛菌P.terrea)、解淀粉欧文氏菌(ErwiniaamylovoraT)、E.toletanaT(=P.toletana)、蚜虫欧文氏菌(E.aphidicolaT)为参比序列，构建系统发育树(图6).结果显示，菌株T18、Ly8与P.agglomerans聚在一起，菌株Ly13、Ly16在泛菌属的分支中，与Erwinia的3个种和Escherichiacoil区分开.

表2 供试菌株的Biolog测定结果Table 2 Biolog results of the strains tested

2.4.5 MLSA结果 用看家基因fusA、gyrB、leuS、pyrG、rpoB和rlpB进行多基因串联建树，以胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacteriumcarotovorumsubsp.carotovorum)为外群，并在NCBI上下载成团泛菌(P.agglomeransT)以及与成团泛菌亲缘关系密切的菠萝泛菌(P.ananatisT)、分散泛菌(P.dispersaT)和斯氏泛菌(P.stewartiiT)作为参比序列，用GTR+I+G模型，在MAGE 5软件上采用最大似然法建树(图7).结果显示，供试菌株与H11以及P.agglomerans模式菌株聚在一起.

3 讨论与结论

成团泛菌广泛存在于大自然中，通常被认为是一种腐生菌或次生菌.但近年来研究发现成团泛菌可使多种植物发病，有些被确定为植物病害的病原菌[2-6]，有些被认为是植物病害的机会致病菌[7]，还有些被认为是伴生病原菌[15].作者从福建省古田县采集的桃李细菌性穿孔病的标本中，有65%以上的病斑均能分离到树生黄单胞菌桃李致病变种和成团泛菌2种细菌，将2种细菌菌株分别单独接种或混合接种于桃和李叶片均能造成与田间相似的症状.因此认为成团泛菌是桃李细菌性穿孔病的新病原.

本研究通过16S rDNA基因分析仍无法将供试的30株菌株准确划分到种.Deletoile et al[14]研究表明，基于fusA、gyrB、leuS、pyrG、rplB、rpoB等6个看家基因的MLSA可以很好地将泛菌属的P.agglomerans、P.ananatis、P.dispersa、P.stewartii、P.citrea、P.punctata和P.terrea等7个种区分开.因此，本研究通过这6个看家基因联合建树，结果表明，供试的30株菌株均与成团泛菌聚在一支.结合传统的生理生化特性和分子生物学鉴定结果，最终将分离获得的30株细菌菌株鉴定为成团泛菌(P.agglomerans).

成团泛菌作为桃李细菌性穿孔病的病原菌之一，与已报道的树生黄单胞菌之间的关系还需要进一步的研究.此外，有研究表明，成团泛菌可通过水平基因转移获取其他病原菌的一种包含致病岛的质粒，从而演变成寄主专化型的致病菌[16].本研究获得的成团泛菌，其致病性是该菌原本就具备还是从树生黄单胞菌上获取了某些致病基因，仍需要进一步探究.