血清miR-19b-3p对阿尔茨海默病大鼠认知水平的影响

李万里

(开封市中心医院神经内科，河南 开封 475000)

阿尔茨海默病是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退化疾病。临床上主要以记忆障碍、失认、失语、失用为主要表现特征[1]。65岁以前的发病者，称为早老性痴呆；六十五岁以后的发病者，称为老年性痴呆[2]。目前，阿尔茨海默病已经成为威胁人们健康的重大疾病之一，其发病率和致残率高的特点严重影响着人们的健康生活[3]。血清miR-19b-3p是一种具有调控因素表达作用的非编码小分子，可稳定存在于人体的血清中[4]。越来越多的研究表明通过检测血清中minRNA的种类、数量，可以反映机体的生理状况和疾病种类[5]。本研究主要是通过分析阿尔茨海默病大鼠的血清miRNA表达谱，再筛选出差异表达基因，在大鼠及细胞中高表达miRNA后，研究大鼠的认知能力及细胞中BACE1蛋白的水平，为阿尔茨海默病大鼠的治疗提供一定的临床参考价值，现研究报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

(1)实验动物：选用上海斯莱克实验动物有限公司的大鼠，鼠龄为8～12 w，体质量为200～300 g，采用随机提取和分笼培养的方法将其培养在室温21～26 ℃，湿度60%～70%的环境中；(2)分组采样：选取阿尔茨海默病大鼠32例作为观察组，其中雄性大鼠18例，雌性大鼠14例。非阿尔茨海默病大鼠32例作为对照组，其中雄性大鼠16例，雌性鼠16例。采集血液10 mL，置于温度4 ℃、转速3000 r/min、半径3 cm的环境中，离心10 min，将收集到的血清放置于Eppendorf管，保存于-80 ℃的环境中；(3)细胞及细胞株培养：选用中科院上海细胞库的人神经母细胞瘤，将其培养在含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养液，室温37 ℃，CO25%的环境中。

1.2 方法

1.2.1 提取RNA

采用Trizol提取血清样品总RNA，然后对其进行Illumina/Solexa测序。实验中采用Illumina HiSeq2500测序仪(深圳华大基因科技有限公司)对患有阿尔茨海默病的观察组和体检健康的对照组进行高通量测序。首先，将miRNA文库连接到Illumina公司的芯片上，进行固相桥梁扩增法，经过30轮的扩增后，使其成为单克隆簇。其次，应用边合成边测序的原理进行enomeAna-lyzer系统测序。最后，将数据转移到自动分析通道进行二次分析。

1.2.2 大鼠建模

通过无菌生理盐水将Aβ1-40稀释成2 μg/μL的状态，在室温37 ℃的环境下培养1 w的时间，将其转变成聚焦状态的Aβ。将10%的水合氯醛经腹腔注射到大鼠的体内来麻醉大鼠。将大鼠头顶部的毛发进行剔除，暴露出大鼠的颅骨，根据前囟进行定位，旁开2.6 mm，后开3.0 mm，下开3.0 mm，在大鼠的颅骨上用牙钻开两个对称的小孔作为海马区的注射点。用针挑破大鼠的硬脑膜，注射5 μL的Aβ-40于双侧海马区域，并在10 min内注射完成，留针10 min后再缓慢撤针。对照组大鼠注射等量的生理盐水，其余的操作过程和观察组相同。最后，将针孔用牙托粉进行填补，缝合前采用庆大霉素进行消毒处理，手术后采用单笼饲养的方法将大鼠饲养至完全清醒。

1.2.3 水迷宫实验

利用随机数表法将60只大鼠分为4组，分别为正常组、阿尔茨海默病组、阿尔茨海默病联合miR-19b-3p组和阿尔茨海默病联合Vector组，每组为15只大鼠。正常组大鼠大脑的双侧海马区给予注射生理盐水。阿尔茨海默病组大鼠的Aβ蛋白注射为痴呆模型，大鼠大脑的双侧海马区注射Aβ。阿尔茨海默病联合miR-19b-3p组大鼠尾静脉注射miR-19b-3p的慢性毒质粒。阿尔茨海默病联合Vector组大鼠尾静脉注射空载质粒。4组大鼠注射后4 d进行定向航行实验，7 d进行水迷宫实验。大鼠开始入水时，将其面向水池壁缓慢的投放到水中，在2 min之内大鼠没有找到平台，通过人将其引导到平台上进行休息30 s，结束本次的训练。若大鼠在2 min之内可以自行找到平台，让其在平台上进行休息30 s，结束本次的训练。不同方向的训练时间间隔为60 s，在训练的过程中进行视频拍摄和全程跟踪。

1.2.4 细胞转染

利用细胞转染的方法将合成的miR-19b-3p模拟剂和抑制剂转染到SH-SY5Y的细胞系中，将其分别作为模拟组和抑制组，而没有采用细胞转染的SH-SY5Y的细胞系为无转染组。随后选取复苏后传代3次以上培养的SH-SY5Y细胞，等待细胞密度增至50%～70%时，将其培养基更换为无血清无双抗培养基，利用jetPRIME转染试剂盒进行转染，待转染5 h后将其培养基更换为完全培养基继续培养24 h。

1.2.5 Western blot检测BACE1蛋白表达

通过提取转染后SH-SY5Y细胞的总蛋白，经BCA试剂盒(碧云天公司，中国)检测模拟组、抑制组和无转染组的蛋白浓度。将变性后的蛋白样品上样经过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(浓缩胶45 V，分离胶100 V)后，将其转到PVDF膜(Millipore公司，美国)上，PVDF膜采用5%的脱脂奶粉的1×TBST(1×TBST中加入0.2%的Tween-20)，在室温4 ℃的环境下进行密封过夜。其中，1×TBST一共洗膜4次，共40 min，一抗BACE1(1∶1000稀释，Epitomics公司，美国)室温4 ℃下进行培养过夜，1×TBST洗膜后。二抗辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG(1∶1000稀释，Goat-anti Mouse HRP-IgG，碧云天公司，中国)室温孵育1 h，经过1×TBST洗膜后，采用ECL试剂盒进行显色、显影和定影处理。同一张膜抗体的洗脱以后，将检测GAPDH蛋白条进行检测，最后作为内参。

1.3 观察指标

(1)观察组相比于对照组高通量测序后的miRNAs水平；(2)miR-19b-3p对阿尔茨海默病大鼠认知功能的影响；(3)SH-SY5Y细胞中BACE1蛋白浓度的表达水平。

1.4 统计学方法

采用SPSS 18.0统计软件进行数据分析。观测数据主要是计量资料，正态计量资料的多组间比较采用单因素方差分析，多重比较为HSD-q检验。偏态资料的组间比较为秩检验，检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 高通量测序结果—miRNAs水平比较

两组样本均经高通量测序，所获miRNAs水平资料见表1。由其知，观察组相比于对照组而言，血清中miR-146a-5p、miR-195-5p、miR-20b-5p水平上调(P<0.05)。miR-125b-3p、miR-19b-3p水平下调，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表1 两组高通量测序后的miRNAs水平比较(n=15)

注：本表“倍数K[ Log2(AD /Control)]”=算术倍数值的以2为底的对数值，即算术倍数=2K

2.2 miR-19b-3p对阿尔茨海默病大鼠认知功能的影响水平

整体比较(单因素方差分析)知：整体组间差异有统计学意义(P<0.05)。多重比较并结合主要数据分析：阿尔茨海默病组或阿尔茨海默病联合Vector组与正常组相比，逃避潜伏期明显增加(P<0.05)。阿尔茨海默病联合miR-19b-3p组与阿尔茨海默病组相比，逃避潜伏期明显减少，差异具有统计学意义(P<0.05)。数据及详细的比较结果见表2。

2.3 SH-SY5Y细胞中BACE1蛋白浓度的表达水平

仿前做整体比较，整体组间差异有统计学意义(P<0.05)。多重比较并结合主要数据分析：模拟组相比于无转染组SH-SY5Y细胞中BACE1蛋白浓度明显减少(P<0.05)。抑制组相比于无转染组SH-SY5Y细胞中BACE1蛋白浓度明显增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。数据及详细的比较结果见表3。

表2 miR-19b-3p对阿尔茨海默病大鼠认知功能的影响水平

注：a表示与正常组相比，P<0.05；b表示与阿尔兹海默病组相比，P<0.05；c表示与阿尔兹海默病联合Vecter组相比，P<0.05

表3 SH-SY5Y细胞中BACE1蛋白浓度的表达水平

注：a表示与无传统组相比，P<0.05；b表示与模拟组相比，P<0.05

3 讨 论

阿尔茨海默病是一种常见的中枢神经系统变性疾病，发病时伴随的临床特征主要有记忆力下降、认知能力下降、生活自理能力下降等[6]。目前，对于阿尔茨海默病的发病原因尚不明确，但根据已经掌握的资料显示，阿尔茨海默病与大脑的炎性反应有着重要的关联[7]。miRNA是一种在真核生物中发现的一类内源性的具有调控基因表达的非编码小分子RNA，大小约为20～25个核苷酸[8]。成熟的miRNA是由较长的初级转录物经过一系列的核酸酶的剪切加工而产生的，随后组装进入RNA诱导的沉默复合体中，通过碱基互补配对的方式识别出靶mRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻止靶mRNA进行翻译[9-10]。在人体内miRNA的数量及指标的异常还可以促进或延缓EMT，也与肿瘤的转移和预后有很大的关联[11]。因此，可以通过检测血清中miRNA的数量、种类，达到检测反应机体生理状况是否正常的目的。

本文通过研究血清miR-19b-3p对阿尔茨海默病认知水平，来进一步探究其作用效果。本研究结果表明，观察组相比于对照组而言，血清中miR-146a-5p、miR-195-5p、miR-20b-5p水平上调，而miR-125b-3p、miR-19b-3p水平下调。其结果表明，阿尔茨海默病的发生与这五种差异表达基因有着重大的联系，其中miR-146a-5p、miR-195-5p、miR-20b-5p和miR-125b-3p均有文献报道[12]，认为其可以作为阿尔茨海默病的生物标志，而miR-19b-3p尚无相关的文献报道，需要进一步挑选miR-19b-3p作为研究对象在动物细胞上进行研究。阿尔茨海默病组或阿尔茨海默病联合Vector组与正常组相比，逃避潜伏期明显增加。其结果表明，大鼠建模成功，可以进一步分析转染后SH-SY5Y细胞中BACE1的蛋白浓度。阿尔茨海默病联合miR-19b-3p组与阿尔茨海默病组相比，逃避潜伏期明显减少。其结果表明，miR-19b-3p与阿尔茨海默病的表现有着密切的联系，miR-19b-3p可以作为阿尔茨海默病的生物标志，并且高表达水平的miR-19b-3p可以改善阿尔茨海默病大鼠的认知能力。模拟组相比于无转染组SH-SY5Y细胞中BACE1蛋白浓度明显减少，抑制组相比于无转染组SH-SY5Y细胞中BACE1蛋白浓度明显增加。其结果表明，在SH-SY5Y细胞中BACE1的表达可以被miR-19b-3p进行负向的调控，表明BACE1可能是miR-19b-3p的靶细胞，血清miR-19b-3p可通过干预BACE1的表达来改善阿尔茨海默病大鼠的认知功能。

综上所述，miR-19b-3p可能会通过调节BACE1的表达来参与阿尔茨海默病的形成，通过干预BACE1的表达还可以改善阿尔茨海默病大鼠的认知功能，可以为今后阿尔茨海默病的治疗提供一定的临床参考。