乳杆菌计数测试片凝胶特性与显色特性的研究

何湃，陈萍，王尹潇，董娜,任常菲，史艳宇

（1.吉林农业大学食品科学与工程学院，长春130022；2.吉林省食品检验所，长春130012）

0 引 言

乳杆菌是一种革兰阳性、厌氧或兼性厌氧、无芽孢杆菌，具有调节肠道菌群、增强免疫力、改善肠道功能、促进消化等作用。目前我国乳中乳杆菌计数依照GB 4789.35-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》[1]进行测定，国标的乳杆菌检测程序较为繁琐，所以发展便捷方法计数乳杆菌产品市场前景十分广阔，计数测试片法是当前非常理想的检测方法。其中以冷水可溶凝胶为载体的测试片比较先进并且应用广泛，菌落生长良好，培养周期短，但进口测试片仍存在价格昂贵等问题，会提高检测成本。国内几家微生物公司近年来也陆续推出了不同类型的微生物测试片，例如以无纺布为载体和以冷水可溶性凝胶为载体的微生物测试片。虽然这些测试片便于携带且操作方便，但陈春田等[2]将国产测试片与传统方法进行比较，测试片在规定培养时间内有菌落生长，但菌落数低于传统方法且存在显著性差异。针对上述存在的问题，本研究着重改良乳杆菌测试片凝胶特性与显色特性，提高菌落生长及显色效果。

本实验室前期研究了冷水可溶性凝胶的凝胶与质构特性，发现凝胶质构对微生物生长有着非常重要的影响[3]，所以本研究着重对于乳杆菌计数测试片的凝胶特性与显色特性进行系统研究，筛选出乳杆菌测试片最优冷水可溶性凝胶配比，为培养乳杆菌提供适宜的生长环境。并优化培养基显色剂，对照菌落生长状况及显色效果筛选出显色剂最适宜浓度，根据显色剂与乳杆菌特异代谢物发生显色反应的原理，使菌落显色清晰，对乳杆菌进行鉴别和计数[4]。本研究通过对乳杆菌测试片凝胶特性和显色特性的研究，研制出一种操作便捷，计数准确的乳杆菌测试片产品。

1 材料与方法

1.1 试验材料

牛肉粉、蛋白胨等，陆桥技术（北京）有限公司；2,3,5-氯化三苯基四氮唑、瓜尔胶、结冷胶、聚丙烯酸钠、卡拉胶，西亚生化试剂发展有限公司和拉丁试剂（上海）有限公司。

1.2 主要仪器与设备

FA1004B型电子天平，上海精天电子仪器厂；ZDX-35BI型座式自动电热压力蒸汽灭菌器锅，上海申安医疗器械厂；Dwv.781型电热恒温培养箱，上海新苗医疗器械制造有限公司；U 410型超低温冰柜，广州吉源生物科技有限公司；DHG-9140A电热恒温鼓风干燥箱，上海捷呈实验仪器有限公司；原泰奇气式粉碎机，北京锟捷玉诚机械设备有限公司；BROOKFIELD LFRA-4500质构仪，杭州嘉维创新科技有限公司。

1.3 试验菌株

乳杆菌属（Lactobacillus）CICC 10481，类干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）CICC 20241于吉林农业大学实验室保存。

1.4 菌悬液制备

菌悬液的制备：将培养的乳杆菌单菌落接种于100 mL MRS液体培养基中，放入恒温培养箱中于36±1℃培养48 h。取25 mL菌液加入225 mL无菌生理盐水后混匀，制成1:10的稀释液。取1:10的稀释液1 mL加入9 mL的生理盐水中，充分混匀，制成系列稀释度菌悬液备用。

1.5 测试片制备

测试片上层膜为高透明度、无刺激性气味、防水透气、无毒的PET透明硅胶膜；中层支撑材料为透明度高，硬度较好，带有镂空区域的聚丙烯（PP）透明塑料板，厚度为0.18 mm；底层材料为印有淡橘色1×1 cm网格、防水防渗透的白色铜版纸。将上、中、下三种材质剪裁为长度9 cm，宽度8 cm，采用无毒无味的聚丙烯酸树脂压敏胶进行粘合，粘合宽度为5 mm；中层支撑材料PET透明塑料板与底板构成半径为3 cm的培养区域。将培养基均匀加入到中间镂空区域。乳杆菌计数测试片的培养基是国标MRS培养基，成分为葡萄糖20 g/L、蛋白胨10 g/L、牛肉粉5 g/L、酵母粉4 g/L、吐温-80 1.0 mL/L、磷酸氢二钾2 g/L、柠檬酸三铵2 g/L、醋酸钠5 g/L、硫酸镁0.2 g/L、硫酸锰0.05 g/L、2,3,5-氯化三苯基四氮唑0.08 g/L。灭菌方法采用环氧乙烷灭菌法[5]。

1.6 测试片计数方法

测试片计数方法采用GB 4789.2-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》[6]，按照国家标准规定，选取菌落数在30～300 CFU之间、无蔓延菌落生长的测试片计数菌落总数。低于30 CFU的测试片记录具体菌落数,大于300 CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个测试片菌落数的平均数。

1.7 冷水可溶性凝胶及质构特性研究

1.7.1 凝胶配制

根据本实验室前期课题组实验结果[7]，选取4种冷水可溶性凝胶：瓜尔胶、结冷胶、聚丙烯酸钠、卡拉胶，复配冷水可溶性凝胶按瓜尔胶、结冷胶、聚丙烯酸钠、卡拉胶5∶2∶2∶1比例配制。将瓜尔胶、结冷胶、聚丙烯酸钠、卡拉胶4种凝胶剂及按上述比例配制的复配胶使用原泰奇气式粉碎机粉碎成粉末，过120目标准筛[8]。

1.7.2 凝胶复配对凝胶及质构特性的研究

1.7.2.1 4种冷水可溶性凝胶与复配胶凝胶特性的测定按照文献方法[9-10]对瓜尔胶、结冷胶、聚丙烯酸钠、卡拉胶4种冷水可溶性凝胶及复配胶凝胶特性进行测定。分别测定其扩散时间、扩散速度、浊度、保水率和吸水率。将不同的胶体溶液于室温下放置24 h，在550 nm下测定吸光度 (A) ，根据公式（1）计算透光度，以去离子水作为空白对照。同时测定1.0% 琼脂的透光度。

式中：A=吸光度，T=透光度

称取1.0 g凝胶粉末，放入9 cm的培养皿中，加入10 mL去离子水，待室温条件下充分溶胀后，将多余水分过120目标准筛滤去，记录滤液量，利用公式（2）计算复配胶的保水率，并以1.0% 琼脂作为对照。

式中：M 1为吸水前凝胶剂和水的总质量；M 2为滤出水的质量[11]。

1.7.2.2 4种冷水可溶性凝胶与复配胶质构特性的测定对瓜尔胶、结冷胶、聚丙烯酸钠、卡拉胶4种冷水可溶性凝胶及复配胶进行质构测定。分别测定其脆性、黏性、黏度、硬度、弹性、咀嚼性、内聚性及回弹性。参考Ramirez J.A.[12]的方法将凝固的凝胶装入2 cm为半径的铝盒中，使用质构仪（BROOKFIELD LFRA-4500）测定凝胶特性，同时测定1.0% 琼脂凝胶特性。质构仪的参数设置如下：采用P/0.5探头，测试速度：5.0 mm／s，触发力：5 g，压缩比：50% 。

1.7.2.3 复配冷水可溶性凝胶与MRS培养基混合比例及质构特性的测定

配制复配冷水可溶性凝胶与MRS培养基的混合溶液，复配冷水可溶性凝胶与MRS培养基配比为1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5。参考D Ren[13]的方法使用质构仪测定5种配比下的质构，同时测定1.0% 琼脂作为对照。

1.8 显色特性研究

1.8.1 显色原理

显色培养基是基于目标菌中一种或多种的酶水解显色底物使菌落本身显色，显色物质只沉积在菌落上而不扩散在培养基中[14]。当显色剂2,3,5-氯化三苯基四氮唑被乳杆菌细胞吸收后，能接受细胞脱氢酶中的氢，还原为一种红色、稳定、不易扩散、不溶于水的三苯甲臜，使乳杆菌菌落显红色，根据其显色效果对乳杆菌菌落数进行计数。

1.8.2 显色剂2,3,5-氯化三苯基四氮唑的剂量优化

在灭菌后的MRS培养基中分别加入0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09 g/L的显色剂2,3,5-氯化三苯基四氮唑，保持其他成分不变，充分混匀配制成培养基粉末。将复配冷水可溶性凝胶粉末与MRS显色培养基粉末按质量比3∶7配制，再将得到的混合粉末均匀涂抹在塑料中层板的培养区域内并压实；向培养区域加入适当稀释度的菌悬液1 mL，置于36±1℃恒温培养箱培养48 h，观察菌落显色效果及菌落形态，确定显色剂的最适添加量，评价乳杆菌测试片显色特性。

1.9 测试片检测性能评价

1.9.1 灵敏度检测

将制备好的乳杆菌试验菌株菌悬液，以无菌生理盐水进行10倍梯度稀释至10-2～10-6CFU/mL，使用测试片法和国标平板计数法对乳杆菌进行培养，对红色菌落计数。重复试验三次，结果取平均值，以最低稀释度的检测结果作为最低检测限，以最低检测限作为测试片灵敏度的检测标准。检测结果大于最低检测限的计为阳性，结果小于最低检测限的计为阴性，灵敏度=阳性/ (阳性+阴性) 。

1.9.2 准确度检测

将制备好的乳杆菌试验菌株菌悬液，以无菌生理盐水稀释至10-2CFU/mL，将菌悬液接种于乳杆菌计数测试片上，以国标平板培养法作为对照，将测试片和平板放入恒温培养箱中36±1℃培养48 h，进行菌落计数。建立乳杆菌测试片法和国标平板法检测结果的标准曲线，将试验结果转换为log10的值，以水平x轴作为国标平板计数法的检测结果，垂直y轴作为测试片法的检测结果，绘制曲线，根据相关系数判断准确度。

1.10 数据统计和分析

试验数据使用Origin 19.0和IBSSPSS 20.0软件进行统计分析，各组数据均采用单因素ANOVA方差分析，设定显著水平为P<0.05，各组试验重复三次，取平均值。结果用平均值±标准差 (SD) 表示。

2 结果与分析

2.1 测试片凝胶特性研究

2.1.1 冷水可溶性凝胶吸水率、保水率、扩散速度等凝胶特性及质构测定

本研究选取4种适宜乳杆菌生长条件的冷水可溶性凝胶 (瓜尔胶、结冷胶、聚丙烯酸钠、卡拉胶) 及复配冷水可溶性凝胶，分别测定吸水率、保水率、扩散速度等凝胶特性。如表1所示，对比吸水率、浊度、扩散时间。瓜尔胶吸水率为56.22 mL/g,卡拉胶为34.22 mL/g，持水性较差；聚丙烯酸钠吸水速度过快，导致样液不能均匀扩散，易形成结块。以国标琼脂做对比，聚丙烯酸钠和结冷胶的浊度比琼脂高，透光度较低，不利于菌落计数。扩散时间卡拉胶仅为0.2 s，扩散速度过快不易在冷水中充分水化形成平滑的胶体;结冷胶为1.2 s，扩散速度慢，不利于菌液均匀分布。复配冷水可溶性凝胶的扩散速度为0.5 s，吸水率为151.52 mL/g，保水率为89.22 mL/g，浊度为81% 。复配冷水可溶性凝胶扩散速度适中，利于菌液在培养区域的扩散；浊度较低，利于菌落计数。对比单一凝胶剂与复配胶的凝胶特性，复配冷水可溶性凝胶能够为乳杆菌提供更良好的生长条件。

测定4种不同冷水可溶凝胶及复配冷水可溶性凝胶的质构特性，如表1所示，复配冷水可溶性凝胶质构特性为硬度2445.81、黏度-35.85、黏性672.58、回弹性0.116，与国标琼脂对比无显著性差异 (P>0.05) 。

2.1.2 复配冷水可溶性凝胶与MRS培养基混合比例及质构特性

通过对比按不同比例配制的复配冷水可溶性凝胶与M RS培养基混合溶液的质构特性，由表2所示，当复配冷水可溶性凝胶与MRS培养基配比为3∶7时，扩散速度为1.9 s。测定的硬度，脆性，粘着性，弹性，内聚性，胶着性，回弹性与1.0% 的琼脂对比，无显著性差异 (P>0.05) 。因此复配冷水可溶性凝胶可替代琼脂作为凝胶剂应用于乳杆菌测试片中，为乳杆菌提供适宜的生长环境。

表1 冷水可溶性凝胶特性及质构测定结果

表2 冷水可溶性凝胶与MRS培养基不同配比的质构分析

2.2 测试片显色特性研究

显色剂2,3,5-氯化三苯基四氮唑可以使乳杆菌菌落显红色，便于区分菌落和杂质，有利于计数。由表3所示，分别添加0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09 g/L显色剂2,3,5-氯化三苯基四氮唑，48 h观察菌落显色效果。由图1所示，当测试片显色剂浓度达到0.08 g/L及以上时，菌落生长良好，显色清晰，为节约成本选用0.08 g/L作为显色剂2,3,5-氯化三苯基四氮唑的最佳添加量，菌落显色清晰，有效用于乳杆菌测试片的显色计数。

表3 显色剂浓度对菌落显色的影响

图1 添加不同浓度显色剂的显色效果

2.2.1 灵敏度检测

进行乳杆菌测试片和国标平板培养法的对比试验，测试片的最低检测限为3 CFU/mL，以最低检测限作为测试片灵敏度的检测标准。两种方法可达到相同水平的检测限。对30～300 CFU/m L之间的菌落数进行分析，t=0.095，P=0.5>0.05，表明利用测试片和国标平板培养法生长的乳杆菌计数结果无差异显著性，结果如表4。

表4 测试片灵敏度测定

2.2.2 准确度检测

对乳杆菌测试片和国标平板培养法的结果进行对比。进行样本独立样本t检验，t=-0.025，P=0.8>0.05，由图2可知，R2达到0.996，具有很好的线性关系，表明两种方法对乳杆菌的菌落计数无差异显著性。

图2 两种方法的线性相关曲线

3 结 论

本研究通过测定瓜尔胶、结冷胶、聚丙烯酸钠、卡拉胶4种适宜乳酸菌生长的冷水可溶性凝胶及复配冷水可溶性凝胶的吸水率、保水率、浊度、扩散速度等凝胶特性，复配后的凝胶扩散速度为0.5 s，吸水率为151.52 mL/g，保水率为89.22 mL/g，浊度为81% 。通过测定4种冷水可溶性凝胶及复配冷水可溶性凝胶的质构特性，复配冷水可溶性凝胶的硬度、黏度、黏性、回弹性与国标琼脂对比，无显著性差异 (P>0.05) 。通过测定复配冷水可溶性凝胶和MRS培养基混合后不同配比的硬度，脆性，粘着性等质构特性，确定复配冷水可溶性凝胶与MRS培养基配比为3∶7，与1.0% 的琼脂对比，无显著性差异 (P>0.05) 。复配冷水可溶性凝胶可应用于乳杆菌测试片中，为乳杆菌提供适宜的生长环境。

本研究通过对照试验筛选不同浓度的显色剂2,3,5-氯化三苯基四氮唑，对比菌落生长情况及显色效果，确定显色剂2,3,5-氯化三苯基四氮唑浓度为0.08 g/L。乳杆菌显色培养基成分可促进乳杆菌菌落生长，使菌落显色清晰，有效用于乳杆菌测试片的显色计数。

本研究制备出乳杆菌显色计数测试片，对乳中乳杆菌进行计数检验，菌落显色清晰，操作便捷，计数准确，准确率达到99% ，最低检测限达到3 CFU/mL。