发酵乳中乳酸菌的分离鉴定及特性

付文雯，朱影，罗彤，邵翠翠，黄坤，刘艳，李诗瑶，马弋

（湖北省食品质量安全监督检验研究院，武汉430000）

0 引 言

乳酸菌是发酵葡萄糖，主要代谢终产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏阳性细菌的总称[1]，其中大部分种类被认为是安全的，可以参与体内众多的生理代谢活动，如缓解乳糖不耐症、降低胆固醇、改善免疫功能、抗氧化以及抑制某些病原体的黏附[2-3]。除此之外，乳酸菌对重金属，如铅、镉、铜等在具有良好的吸附能力[4]，可以减少重金属在机体中的蓄积，减轻重金属危害。

乳酸菌在自然界中种类繁多，分布广，在乳制品、肉制品、水果、蔬菜及植物制品上均分离出过乳酸菌，有些种类的乳酸菌甚至存在于人体的口腔、胃肠中[5-6]。因此，深入开展乳酸菌的研究，不仅在菌种获取方面具有切实可行的现实条件，而且对保障食品安全、提高食品营养价值方面也具有重要的现实意义。

1 实 验

1.1 材料与试剂

M RS琼脂培养基，北京陆桥；乳酸杆菌肉汤培养基，青岛海博；牛胆盐，青岛海博；氯化钠，（分析纯）；HCL，（分析纯）；氢氧化钠，（分析纯）等。

1.2 仪器与设备

紫外可见分光光度计，日本日立；MALDI-TOF MS基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱，德国Bruker科技有限公司；p H计，上海仪电科学仪器股份有限公司；恒温培养箱，赛默飞世尔科技 (中国) 有限公司）；冷冻离心机，德国Sigma公司；电感耦合等离子体质谱，ICP-MS美国珀金埃尔默；电子天平，梅特勒-托利多仪器上海有限公司；高压灭菌器，日本TOMY。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分离纯化

称取25 g样品，置于225 mL生理盐水中，均质后，取一环在MRS平板上划线，平板置36℃厌氧培养24～48 h。观察菌落形态，大小。

对不同形态的菌落，分别各挑取一环划MRS平板进行分离纯化，再置36℃培养24～48 h，上基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）进行鉴定。

1.3.2 MALDI-TOF MS对纯化的微生物进行鉴定

挑取单菌落，用无菌棉签涂抹于MALDI靶点上 (每株菌涂抹5靶点) ，覆盖1μL的HCCA基质溶液，室温干燥后，将靶板放入仪器进行检测。

1.3.3 乳酸菌耐胆盐实验

将目标菌活化2代，37℃条件下静置培养24 h，然后以2% 的接种量接入至含有质量浓度为0.1g/100m L，0.2 g/100mL，0.5 g/100mL，0.7 g/100mL，1.0 g/100mL胆盐的乳酸杆菌肉汤培养基中，于37℃恒温静置培养，16 h取样，用紫外分光光度计测定600 nm波长处的OD值。

1.3.4 乳酸菌的耐酸试验

将目的菌株活化2代，37℃条件下静置培养24 h，然后以2% 的接种量接入至p H值 为2.5，3.5，4.5，5.5，6.5，6.8，7.0乳酸杆菌肉汤培养基，在37℃温度下静置培养，用紫外分光光度计测定600 nm波长处的OD值。

1.3.5 氯化钠耐受试验

将目的菌株活化2代，37℃条件下静置培养24 h，然后以2% 的接种量接入至分别含质量分数分别为0% ，2% ，4% ，6% ，8% ，10% 氯化钠的乳酸杆菌肉汤培养基，于37℃恒温静置培养，16 h取样，用紫外分光光度计600 nm波长处的OD值。

1.3.6 乳酸菌铅吸附实验

在15 mL无菌离心管中加入质量浓度100mg/L铅离子水溶液1.0 mL，再分别加入不同体积菌悬液（质量浓度50 g/L），使铅离子水溶液中的菌体终质量浓度分别达到0.5，1，1.5，2，2.5，5，10，25 g/L；最后用肉汤培养基定容至10 mL。恒温培养 (37℃) 60 min，取吸附液离心 (14 000 r/min,5 min) 获得上清液，稀释后使用ICP-MS测定其中铅离子含量。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌的分离与鉴定

从发酵乳中分离出2株革兰氏阳性菌，分别命名为Z1，S1。两株菌均为表面光滑、边缘整齐、大小不一的圆形菌落，其中Z 1为乳白色，S1为白色略为透明。将两株菌分别挑取单菌落纯化后，利用M ALDI-TOF MS获得两株菌的特异性蛋白质指纹图谱，并对图谱中蛋白质标识峰信息与标准数据库进行多重比较，其中Z 1为植物乳杆菌的鉴定分值为2.040，S1为鼠李糖乳杆菌的鉴定分值为2.097，均属于比较可信的鉴定结果。两株菌的质谱图分别如图1和图2所示。

图1 植物乳杆菌飞行时间质谱图

图2 鼠李糖乳杆菌飞行时间质谱图

2.2 乳酸菌耐胆盐实验结果

将菌液接种在不同胆盐浓度的肉汤培养基中培养16 h后，以不含菌体、不含胆盐的肉汤培养基为空白，在OD600nm下，测定吸光度。以胆盐浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，画折线趋势图，如图3所示。由图3可以看出，两株菌均随着胆盐浓度的升高呈下降的趋势，但S1菌株的下降趋势较Z1明显。S1菌株在0～0.1g/100 mL阶段下降趋势最快，（0.1～0.2g）/100 mL 次之，0.2g/100 mL以后逐渐趋于平缓，说明S1菌株的生长对胆盐非常的敏感。Z1菌株从整体上看下降的都比较平缓，在（0.2～0.5 g）/100 m L下降趋势相对最大，随后趋于平衡，说明0.5 g/100 mL胆盐浓度可能是Z 1菌株的一个耐胆盐的临界点。从整体趋势上来看，Z 1菌株较S1菌株耐胆盐，Z 1菌株在胆盐浓度为1.0 g/100 mL的肉汤培养基中，相对不含胆盐的空白管，其OD值仅下降38% ，S1菌株在胆盐质量浓度为0.1 g/100 mL时，相对不含胆盐的空白管其下降率就为63% ，在胆盐质量浓度为0.2 g/100 mL时，下降率就达93% ，基本快趋于不生长。

胆盐耐受能力是益生菌的重要特性之一，有助于益生菌通过胃肠环境并在肠道定殖（正常情况下，人体肠道中的胆盐质量分数约为0.3% ～0.5%[7]），只有当足够数量的活菌成功在大肠定植，乳酸菌才能发挥其益生作用[8]。Z1菌株在胆盐质量浓度为1.0 g/100 mL条件下，也表现出良好的耐受性，对于后期将其作为添加剂应用于产品空间很大。

图3 两株菌在不同胆盐质量浓度培养基中培养16 h后的OD 600 nm值

2.3 乳酸菌耐酸实验结果

将菌液接种在不同pH值肉汤培养基中培养16h后，以不含菌体的肉汤培养基为空白，在OD600nm下，测定吸光度。以p H值为横坐标，吸光度值为纵坐标，画折线趋势图，如图4所示。

图4 两株菌在不同pH值培养基中培养16 h后的OD 600值

由图4可以看出，随着p H值的升高，两株菌液的吸光度均表现出先升高后下降的趋势，均在6.8为最高点，其中S1随着p H值的升高，上升的趋势高于Z 1。在p H为4.5的肉汤培养基中，S1和Z1相对生长最旺盛p H值条件下菌体OD值，其相对生长率分别为52% 和62% ，表现出一定程度的耐酸性。

2.4 乳酸菌氯化钠耐受试验结果

将菌液接种在含不同质量分数氯化钠肉汤培养基中培养16 h后，以不含菌体、不含氯化钠的肉汤培养基为空白，在OD600nm下，测定吸光度。以氯化钠的质量分数为横坐标，吸光度值为纵坐标，画折线趋势图，如图5所示。许多发酵食品的生产中会经常使用NaCl作为主要配料，所以乳酸菌对NaCl的耐受能力会对其在含盐发酵食品中的应用造成影响[9]。从图上我们可以看到S1菌株在氯化钠质量分数从0～2% 过程中，有一个迅速增长的过程，说明低盐可以促进S1菌株的生长，但当质量分数大于2% 后，又急速的下降，在质量分数大于4% 后S1菌株就基本不生长了。Z 1菌株则表现出完全不一样的特性，它在没有氯化钠存在的环境中生长的最好，随着氯化钠质量分数的增加生长逐渐受到抑制，在0～2% 阶段下降速率最快，最后在质量分数大于6% 后基本不生长了。

图5 两株菌在不同质量分数氯化钠培养基中培养16 h后的OD 600值

2.5 乳酸菌铅吸附实验结果

因ICP-MS灵敏度高，检出限低[10]，为防止样品污染仪器，上机前将样品稀释1 000倍，并按照样品中铅溶液含量，配制标准曲线质量浓度为5，10，20，40，50 μg/mL；标准曲线如图6所示，相关系数为0.9992，现性良好。

图6 铅溶液标准曲线

图7 两株菌在不同菌体初始质量浓度下对铅吸附能力

两株菌在不同初始菌体浓度条件下，对铅吸附率结果如图7所示。由图7可以看出，S1菌株的吸附能力整体高于Z1菌株。其中，S1菌株对铅的吸附能力，随着菌体浓度的增加吸附率呈现出先升高后下降的规律。菌体对铅离子良好的耐受能力可能与其细胞表面结构、吸附能力以及对铅离子的外排能力有关[11]。当菌体质量浓度逐渐增加时，溶液中与铅结合的活性位点也相应增多，表现出吸附率升高，但是当菌体质量浓度大到一定程度，菌体之间相互吸附成团，造成活性结合位点减少，反而使单位吸附量降低，吸附率下降[12]。而且细菌体内重金属含量高了之后，也会对其细胞产生毒性，抑制其生长代谢，改变细胞结构，甚至致死，一定程度上也会影响微生物对重金属的结合量和结合率。由图7可以看出，在菌体质量浓度为1.5 g/L时达到最大，然后开始逐渐下降，在质量浓度为5 g/L时趋于稳定。Z 1菌株的吸附率变化不是很规则，在质量浓度为0.5 g/L和5 g/L时分别达到最大吸附量。

3 结 论

本研究从自然发酵的酸奶中分离出2株细菌，经MALDI-TOF MS鉴定为植物乳杆菌（Z1）和鼠李糖乳杆菌（S1），并对其部分生化特性做了分析。结果表明，S1菌株耐酸、嗜低盐、不耐胆盐，对铅有一定吸附能力；Z1菌株耐酸、耐胆盐、耐盐，对铅有一定的吸附作用。通过对两株菌特性的了解，后期可以结合基因工程技术，对细菌DNA进行人为干预，培育出具有特殊功能的乳酸菌，并将其广泛应用于环境中重金属的处理，或者作为食品添加剂应用于功能食品的开发，具有很强的社会效益。Zhai Qixiao等[13]将植物乳杆菌（L.plantarum）CCFM 8610用于去除水果汁和蔬菜汁中的镉，2 h时的去除率为67% ～82% ，并利用此菌株开发出了一款酸豆乳产品，能有效缓解慢性镉暴露对小鼠造成的毒性损伤[14]。不过将乳酸菌做成微生物制剂应用到食品或者环境中还需进一步探索，进行更加全面和深入的研究。